Streptococcus pneumoniae é causa de doenças como pneumonia, otite, meningite e sepse. As vacinas hoje disponíveis têm cobertura limitada porque são baseadas no polissacarídeo capsular, que varia com os mais de 90 sorotipos da bactéria, além de levarem à substituição de sorotipos na população por outros não presentes nas formulações. Visando reduzir o custo e aumentar a cobertura, têm-se estudado vacinas baseadas em proteínas que ofereceriam proteção independente de sorotipo. Este trabalho teve por objetivo a obtenção, avaliação da estabilidade e da resposta imune em camundongos de híbridos de duas proteínas de S. pneumoniae: a proteína de superfície do pneumococo (PspA) e a pneumolisina geneticamente detoxificada (PdT), sem ou com espaçadores moleculares, rígido ou flexível, entre as moléculas. Os genes dos híbridos com espaçadores foram clonados através da técnica de overlap extension PCR. O gene das proteínas foi expresso em E. coli e as proteínas obtidas foram reconhecidas por anticorpos produzidos contra a célula inteira de pneumococo através de Western Blot. A purificação dos híbridos foi feita utilizando homogeneizador de alta pressão, precipitação de impurezas com detergente catiônico CTAB e diferentes etapas cromatográficas. A estabilidade foi analisada periodicamente através de SDS-PAGE e Western Blot. O híbrido sem espaçador mostrou-se instável, por isso a presença de atividade proteolítica foi investigada através de diversos ensaios para detecção dessas enzimas, mostrando que a instabilidade não decorreu de hidrólise por proteases. Os fragmentos resultantes da quebra tiveram a porção N-terminal sequenciada para identificar o sítio de clivagem, que estava localizado na junção das duas proteínas. Esse sítio foi retirado das construções seguintes e espaçadores moleculares foram incluídos entre os dois antígenos. A molécula com espaçador flexível foi obtida na forma solúvel durante o cultivo, porém durante a purificação ocorreu precipitação irreversível. O clone para produção do híbrido com espaçador rígido permitiu a obtenção da proteína, que foi purificada e teve a estabilidade avaliada periodicamente à 4° C e -20° C por Western Blot empregando anticorpos contra célula inteira de pneumococo, indicando que a introdução do espaçador rígido aumentou a estabilidade do híbrido em relação à molécula sem espaçador. Além disso, diferentes concentrações de estabilizantes foram avaliadas, mostrando que em presença de trealose 1M ou glicerol 50% o híbrido com linker rígido permaneceu estável por pelo menos 4 meses a 4° C. A molécula com espaçador rígido produziu níveis de anticorpos em camundongos comparáveis aos níveis obtidos com a molécula sem espaçador, que foram capazes de proteger 100% dos animais em ensaio de desafio letal intranasal e inibir a atividade hemolítica da pneumolisina. O aumento de estabilidade do híbrido alcançado com a inserção do linker rígido juntamente com a retirada do sítio de clivagem e com a presença de estabilizantes permitem que esta molécula seja utilizada numa vacina pneumocócica proteica. Como estudos vêm demonstrando que seria necessário mais de uma proteína para formular esta nova vacina, a produção deste híbrido traz a grande vantagem de obtenção de dois antígenos em um único processo de produção, o que pode resultar em uma diminuição do custo da dose. / Streptococcus pneumoniae is cause of diseases like pneumonia, otitis, menngitis and sepsis. The vaccines available nowadays has limited coverage because they are based on the capsular polysaccharyde, which varies among the more than 90 bacteria serotypes and they lead to serotype substitution on the population for others not present on the vaccine formulations. In order to reduce the cost and increase the coverage, vaccines based on pneumococcal proteins that would offer serotype independent protection have been studied. The objective of this thesis was the obtainment, stability evaluation and immune response evaluation in mice of hybrids composed of two proteins of S. pneumoniae: pneumococcal surface protein A (PspA) and genetically detoxified pneumolysin (PdT), with or without molecular linkers, rigid and flexible, between the molecules. The genes with molecular linkers were cloned using the overlap extension PCR technique. The genes were expressed in E. coli and the proteins were recognized by anti pneumococcal whole cell in Western Blot. The hybrids were purified using high pressure homogeneizer, precipitation of impurities using cationic detergent CTAB and different chromatography steps. The stability was periodically analyzed through SDS-PAGE and Western Blot. The hybrid without linker was unstable and the presence of proteolytic activity was investigated through several methods for protease activity detection, showing that instability was not due to protease hydrolysis. The N-terminal portion of the degraded protein fragments was sequenced in order to identify the cleavage site, which was localized exactly between the two proteins. This site was removed from the other hybrids and molecular linkers were included between the two antigens. The molecule with flexible linker was obtained on the soluble form during expression, but during purification it precipitated irreversibly. The molecule with rigid linker were expressed, purified and had its stability analyzed periodically at 4° C and -20° C by Western Blot using anti pneumococcal whole cell, indicating that the insertion of the rigid linker increased the hybrid stability when compared with the hybrid without linker. Besides that, different stabilizers in different concentrations were evaluated and it was found that the presence of trehalose 1 M or 50% glycerol stabilized the hybrid with rigid linker for at least 4 months at 4 ° C. The molecule with rigid linker produced levels of antibodies in mice comparable to the hybrid without linker. These antibodies were able to protect 100% of animals from lethal intranasal challenge and inhibit the haemolytic activity of pneumolysin. The stability increase due to the rigid linker together with the removal of the cleavage site and the stabilizers presence allow this hybrid molecule to be used on a novel pneumococcal vaccine. Since studies have shown that it would be necessary more than one protein to formulate this new vaccine, the production of this hybrid brings the great advantage of producing two antigens in one single process, which can decrease the dosage cost.

A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é encontrada na superfície de todas as cepas de Streptococcus pneumoniae e candidata promissora para novas vacinas pneumocócicas. Foi desenvolvido um processo de purificação da PspA4Pro cujas etapas iniciais foram: ruptura da biomassa celular, precipitação do homogenato obtido com o detergente brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) e remoção do precipitado por centrifugação. Foram avaliadas cromatografias de troca iônica (aniônica, catiônica), afinidade por metais, interação hidrofóbica e mista de troca catiônica e hidrofóbica. Utilizando precipitação com CTAB, cromatografia de troca aniônica, crioprecipitação em pH4,0 e cromatografia de troca catiônica atingiu-se a pureza requerida de PspA4Pro (>95%) com recuperação entre 14% e 33%. O processo alcançou níveis aceitáveis de endotoxina no produto final e a PspA4Pro purificada foi reconhecida por anticorpos anti-PspA4, manteve sua atividade e sua estrutura secundária. / Pneumococcal surface protein A (PspA) is found in all Streptococcus pneumoniae strains and is a promising candidate to be used in new pneumococcal vaccines. A purification process for PspA4Pro which inicial steps were: cell disruption, precipitation of the homogenate with the cationic detergent cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and pellet removal by centrifugation. The chromatographic techniques tested were ion exchange (anionic and cationic), immobilized metal affinity, hydrophobic interaction and mix mode with hydrophobic and cationic ligands. Using CTAB precipitation, anion exchange chromatography, crioprecipitation in pH4.0 and cation exchange chromatography the PspA reached the required purity (>95%) with recovery between 14% and 33% . The process reached acceptable levels of endotoxin in the final product and the purified PspA4Pro was recognized by anti-PspA4 antibodies and manteined its activity and secondary structure.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria encapsulada causadora de doenças infecciosas como pneumonia, bacteremia e meningite, infecções essas que estão entre as principais causas de morte entre crianças, idosos e imunodeprimidos, indivíduos que constituem o grupo de risco para tais infecções. A vacinação tem sido a mais eficaz forma de conter tais infecções. A vantagem das vacinas conjugadas em comparação às polissacarídicas é a capacidade de indução de uma resposta imune T-dependente o que garante proteção mesmo ao grupo de risco para infecções por S. pneumonia. A proposta do projeto foi estabelecer um protocolo para obtenção de um conjugado constituído pelo polissacarídeo capsular de S. pneumonia sorotipo 1 (PS1) e pela proteína de superfície pneumocócica A (PspA). A síntese do conjugado empregou uma metodologia inédita para o sorotipo 1. A avaliação da resposta imune humoral induzida pelo conjugado mostrou a indução de IgG anti-PS1 gerada pelas imunizações com o conjugado PS1-PspA. / Streptococcus pneumoniae is an encapsulated bacteria causing infectious diseases such as pneumonia, bacteremia and meningitis, these infections are among the leading causes of death among children, elderly and immunocompromised, who constituting individuals of risk group. The vaccination has been the more effective form to counter these infection. The advantage of conjugated vaccines compared to vaccines polysaccharide, is the ability to induce a T-dependent immune response which provides protection even at risk groups for infection by S. pneumoniae. The project proposal was establish a protocol for obtaining a conjugate consisting of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 1 (PS1) and the pneumococcal surface protein A (PspA). The synthesis of conjugate employed a new methodology for serotype 1. The evaluation of humoral immune response induced by the conjugate showed anti-PS1 IgG induction generated by immunization with the PS1-PspA.

A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é encontrada na superfície de todas as cepas de Streptococcus pneumoniae e candidata promissora para novas vacinas pneumocócicas. Foi desenvolvido um processo de purificação da PspA4Pro cujas etapas iniciais foram: ruptura da biomassa celular, precipitação do homogenato obtido com o detergente brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) e remoção do precipitado por centrifugação. Foram avaliadas cromatografias de troca iônica (aniônica, catiônica), afinidade por metais, interação hidrofóbica e mista de troca catiônica e hidrofóbica. Utilizando precipitação com CTAB, cromatografia de troca aniônica, crioprecipitação em pH4,0 e cromatografia de troca catiônica atingiu-se a pureza requerida de PspA4Pro (>95%) com recuperação entre 14% e 33%. O processo alcançou níveis aceitáveis de endotoxina no produto final e a PspA4Pro purificada foi reconhecida por anticorpos anti-PspA4, manteve sua atividade e sua estrutura secundária. / Pneumococcal surface protein A (PspA) is found in all Streptococcus pneumoniae strains and is a promising candidate to be used in new pneumococcal vaccines. A purification process for PspA4Pro which inicial steps were: cell disruption, precipitation of the homogenate with the cationic detergent cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and pellet removal by centrifugation. The chromatographic techniques tested were ion exchange (anionic and cationic), immobilized metal affinity, hydrophobic interaction and mix mode with hydrophobic and cationic ligands. Using CTAB precipitation, anion exchange chromatography, crioprecipitation in pH4.0 and cation exchange chromatography the PspA reached the required purity (>95%) with recovery between 14% and 33% . The process reached acceptable levels of endotoxin in the final product and the purified PspA4Pro was recognized by anti-PspA4 antibodies and manteined its activity and secondary structure.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria encapsulada causadora de doenças infecciosas como pneumonia, bacteremia e meningite, infecções essas que estão entre as principais causas de morte entre crianças, idosos e imunodeprimidos, indivíduos que constituem o grupo de risco para tais infecções. A vacinação tem sido a mais eficaz forma de conter tais infecções. A vantagem das vacinas conjugadas em comparação às polissacarídicas é a capacidade de indução de uma resposta imune T-dependente o que garante proteção mesmo ao grupo de risco para infecções por S. pneumonia. A proposta do projeto foi estabelecer um protocolo para obtenção de um conjugado constituído pelo polissacarídeo capsular de S. pneumonia sorotipo 1 (PS1) e pela proteína de superfície pneumocócica A (PspA). A síntese do conjugado empregou uma metodologia inédita para o sorotipo 1. A avaliação da resposta imune humoral induzida pelo conjugado mostrou a indução de IgG anti-PS1 gerada pelas imunizações com o conjugado PS1-PspA. / Streptococcus pneumoniae is an encapsulated bacteria causing infectious diseases such as pneumonia, bacteremia and meningitis, these infections are among the leading causes of death among children, elderly and immunocompromised, who constituting individuals of risk group. The vaccination has been the more effective form to counter these infection. The advantage of conjugated vaccines compared to vaccines polysaccharide, is the ability to induce a T-dependent immune response which provides protection even at risk groups for infection by S. pneumoniae. The project proposal was establish a protocol for obtaining a conjugate consisting of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 1 (PS1) and the pneumococcal surface protein A (PspA). The synthesis of conjugate employed a new methodology for serotype 1. The evaluation of humoral immune response induced by the conjugate showed anti-PS1 IgG induction generated by immunization with the PS1-PspA.