In this thesis I describe a toxic protein, diamphotoxin, that is present in the pupae of the beetle Diamphidia nigro-ornata. This insect is used as an arrow poison by the !Kung Bushmen inhabiting the savannah of eastern Namibia and western Botswana. Preliminary investigations showed that the pupae contained a 3,7 S cationic protein which caused haemolysis and, after intramuscular injection, local paralysis followed by death. By intravenous lethality assay, one 200 mg pupa contained 20 000 mouse lethal doses. Assays for the toxin were developed based upon haemolysis in vitro and lethality in vivo. These assays were used to monitor purification of the toxin. Diamphotoxin was purified by acid extraction in 0,1M glycine-HCl pH 3,0 followed by ammonium sulphate fractionation, chromatography on hydroxyl apatite, phosphocellulose and, finally, on DEAE cellulose. A consistent increase in activity after the hydroxyl apatite chromatography pointed to the removal of an inhibitor during this step. A subsequent severe loss of activity after chromatography on phosphocellulose could neither be explained nor overcome. The phosphocellulose chromatography step yielded three peaks of toxic activity. Immunological studies revealed cross-reactivity but not identity between these three toxin species. The toxin in the first peak to elute from the phosphocellulose column was purified to electrophoretic homogeneity by chromatography on DEAE cellulose. Attempts to purify the toxin in the other two phosphocellulose peaks were not successful. The isolated molecule was confirmed to be the toxin by haemolysis in a blood-agarose underlay after SDS-gel electrophoresis. The molecular weight estimate for the toxin by SDS-gel electrophoresis was 60 700 daltons and by analytical ultracentrifugation 62 100 daltons. The molecule appeared to exist as a single polypeptide chain. The amino acid composition showed a high proportion of hydrophobic amino acids. Isoelectric focussing showed an isoelectric point of pH 9,45. Toxin mediated haemolysis was studied in detail. The haemolytic event could be broken down into two stages. In the first stage toxin bound irreversibly to the cell but, provided no divalent cations were present, no damage to the cell could be detected. The second stage required the presence of free calcium (or certain other divalent cations), with an optimum concentration at 1 mM. The interaction of calcium with the cell-bound toxin resulted in the cell membrane becoming highly permeable to Na⁺ and K⁺ ions. Experiments designed to detect phospholipase or protease activity in toxin solutions gave negative results. Erythrocytes incubated with ¹²⁵I-labelled pure toxin in calcium-free medium retained a quantity of bound toxin which could not be removed by repeated washing. Incubation of erythrocytes with calcium-free toxin resulted in depletion of the activity of the toxin solution. The kinetics of the haemolytic action of the toxin were shown to be stoichiometric rather than catalytic. It was estimated that haemolysis by the toxin required a minimum of approximately 100 molecules per cell. Studies using circular dichroism measurements and the fluorescent probe 8-anilino-1-naphthalene sulphonic acid (ANS) indicated that a conformational change occurred in the toxin upon exposure to calcium. The ANS studies indicated that upon the addition of calcium the toxin molecule became more hydrophobic. It was concluded that the toxin functions as a calcium regulated Na⁺ and K⁺ ionophore in that it binds to the cell membrane and, in the presence of calcium or certain other divalent cations, assumes a conformation which mediates the free passage of Na⁺ and K⁺ ions. The resultant disruption of normal transmembranous ionic concentration gradients leads to cell lysis by loss of osmoregulation and, in the case of excitable membranes, disruption of electrophysiological activity.

Th. doct.--Histoire--Grenoble 2, 1998. / Bibliogr. p.459-471. Index.

Mémoire de master recherche 2e année : Droit pénal : Lille 2 : 2006. / Bibliogr. f. 84-95.

Thesis (doctoral)--Université Aix-Marseille 1, 1998. / Includes bibliographical references ([438]-462).

Thesis (doctoral)--Université Aix-Marseille 1, 1998. / Includes bibliographical references ([438]-462).

Thesis (MSc.(Anatomy)--Faculty of Health Sciences)-University of Pretoria, 2006. / Includes bibliographical references.

Orientador: Carlos Alberto de Magalhães Lopes / Banca: Silvio Luis de Oliveira / Banca: Vidal Haddad Junior / Banca: Mônica Valdyrce dos Anjos Lopes Ferreira / Banca: Itamar Alves Martins / Resumo: Nossos estudos objetivaram caracterizar as respostas imune inata e específica induzidas pelas peçonhas do muco e do ferrão do bagre Cathorops agassizii . A coleta dos espécimes foi realizada no complexo Baía-Estuário de Santos e São Vicente, localizado no litoral sul do Estado de São Paulo. As peçonhas (do Muco e do Ferrão) apresentaram perfil eletroforético similar entre si. Induzida a inflamação aguda em um modelo experimental murino, as peçonhas apresentaram igualmente a capacidade de induzir aumento da permeabilidade vascular e também edema de pata. A detecção de Leucotrieno B4 e Prostaglandina E2 no lavado da cavidade peritoneal dos camundongos injetados, com ambas as peçonhas, corroboram esta hipótese. Nossos resultados através da microscopia intravital mostraram que as peçonhas induzem um grande número de leucócitos rolantes nas vênulas pós-capilares com focos de extravasamento leucocitário, principalmente de neutrófilos seguido pelo influxo de macrófagos. Além disso, a peçonha do Ferrão induziu uma resolução mais rápida do influxo leucocitário ao contrário da peçonha do Muco que manteve o infiltrado macrofágico por até 7 dias. De maneira interessante, somente a citocina IL-6 foi detectada no lavado peritoneal induzida principalmente pela peçonha do Muco e as quimiocinas KC e MCP-1, por ambas as peçonhas, expressando naquele momento, a participação destes mediadores no recrutamento de neutrófilos e macrófagos para o sítio da lesão. As peçonhas foram eficazes ao induzir uma produção primária e secundária de anticorpos das classes IgM e IgG anti-venenos. Observamos ainda, uma especificidade dos anticorpos produzidos para os componentes das próprias peçonhas e também uma reatividade antigênica cruzada entre elas. / Abstract: Our studies aimed to characterize the innate and specific immune responses induced by poisons of the mucus and sting of the catfish Cathorops agassizii. The collection of specimens was accomplished in the complex Bay-Estuary System of Santos and São Vicente located in the south coast of the São Paulo State. Poisons of the Mucus and Sting presented similarities in their electrophorectical profiles. In basis of an Induced process of inflammation throughout an experimental murine model, both poisons equally showed the capacity to increase the vascular permeability and also paw edema. The Leucotrien B4'S and Prostaglandine E2 detection in washings of mice peritoneal cavity injected with both poisons corroborates this hypothesis. Our results through an intravital microscopy procedure also showed that the poisons induced a great number of rolling leukocytes in the post-capillary venules with focus on the leukocyte overflow mainly neutrophiles followed by macrophage influx. Besides, the sting poison Sting induced a faster resolution of the leukocyte influx, as well as, the Mucus poison unlike maintained a macrophage infiltrated for up to 7 days. In an interesting way, only the cytokine IL-6 was detected in peritoneal washings induced mainly by the Mucus poison although Quimiokinins KC and MCP-1 were for both poisons, expressing on that moment the participation of these mediators in the neutrophile and macrophage recruitment for the lesion site. The poisons were also effective in the induction of a primary and secondary production of IgM and IgG classes of antibodies. In this research we still observed a specificity of the antibodies produced for the components of the own poisons and also a crossed antigenic reactivity among them. / Doutor

En 2021, les cancers sont toujours une des principales causes de mortalité au niveau mondiale. C'est d'une part, une compréhension croissante des phénomènes biologiques liés au développement des cancers et d'autre part, l'évolution des traitements qui nous ont permis d'obtenir et de constamment accroître les taux de guérison et de rémission pour certains types de cancer (ex. cancers du sein, du poumon, du côlon). Mais malgré une pléthore de traitements antitumoraux et l'évolution de techniques médicales aussi bien curatives que diagnostiques, certains cancers sont toujours des maladies difficiles à traiter et restent associés à des prognostiques très négatifs (ex. cancers du pancréas, du cerveau), dès lors le besoin de nouvelles molécules antitumorales est toujours cruellement nécessaire.Ce travail s'inscrit dans ce contexte de développement de nouveaux complexes métalliques possédant des propriétés anticancéreuses ainsi qu'à leur évaluation biologique et à la compréhension de leur mécanisme d'action. L'intérêt des complexes métalliques comme potentiels agents anti-cancéreux a commencé dans les années 60 par la découverte fortuite de la puissante activité antiproliférative du cisplatine. Cette étape a été déterminante et a orienté plus de cinquante années de recherche. De nos jours, les médicaments à base de platine ont toujours une place importante dans l'arsenal thérapeutique anticancéreux, en effet le cisplatine, le carboplatine et l'oxaliplatine sont administrés chez plus de 50% des patients qui reçoivent une chimiothérapie. Néanmoins l'usage des traitements à base des molécules dérivées de platine soulèvent deux problèmes majeurs ;l'apparition d'effets secondaires sévères due au manque de sélectivité pour les cellules tumorales, ainsi que l'émergence de lignées tumorales résistantes à la suite des traitements à base de dérivés de platine. Ceci explique la raison pour laquelle les chercheurs se sont concentrés sur le développement de nouveaux complexes métalliques à visée anticancéreuse.Le laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique de la faculté de Pharmacie de l'Université Libre de Bruxelles, a acquis au fil des années en expertise dans le développement de complexes de platine possédant de puissante activité antiproliférative. L'intérêt grandissant pour de nouveaux métaux potentiellement anticancéreux a mené notre laboratoire vers une nouvelle thématique de recherche :le développement de complexes métalliques de ruthénium et d'osmium potentiellement anticancéreux. Notre choix s'est arrêté sur ces deux métaux pour deux raisons principales :(1) Ces deux métaux étant consécutifs dans la colonne 8 du tableau période, ils sont censés partager certaines similitudes en termes de réactivité, en raison de la similarité de leurs couchesélectroniques externes. Ceci nous offre donc la possibilité de préparer des composés similaires différant uniquement par la nature du centre métallique (ruthénium ou osmium).(2) De nombreux complexes prometteurs ont été rapportés dans la littérature :trois complexes de ruthénium (KP1019, NKP1339 et NAMI-A) sont entrés en essais cliniques et certains composés d'osmium (azpy-type complexes) sont actuellement intensivement étudiés pour leurs propriétés anticancéreuses liées à des mécanismes catalytiques.Ce travail se veut être un cheminement classique dans le domaine de la chimie médicinale, du design rationnel à la sélection des composés les plus actifs pour une évaluation biologique plus approfondie. Chronologiquement, la première partie de ce travail de thèse a consisté en la synthèse de nouveaux dérivés de ruthénium et d'osmium. Ces composés ont été préparé sur base d'un design rationnel. Nous avons considéré trois approches pour préparer nos complexes :(1) Coupler un groupement biotine (vit B7) afin d'augmenter la sélectivité envers les cellules tumorales qui ont tendance à surexprimer le récepteur à la biotine afin de maintenir leur rapide croissance et division.(2) Coupler un groupement 4-(2-aminoethyl)morpholine afin de favoriser une accumulation toxique intralysosomale avec pour finalité la libération de composés pro-apoptotiques menant à la mort cellulaire.(3) Coupler une chaine alkyl-C16 afin d'augmenter drastiquement la lipophilie des complexes permettant d'augmenter fortement leur accumulation cellulaire et par conséquent leur activité antiproliférative.Parmi ces trois stratégies, l'augmentation de la lipophilie fut la seule à pouvoir confirmer expérimentalement une de nos hypothèses de départ. La suite logique de ce travail fut consacrée à la compréhension des mécanismes d'activation et d'action de ces nouveaux complexes possédant une puissante activité antiproliférative. Les résultats obtenus durant ces six années de thèse furent donc reportés et divisés en deux parties principales dans la section « Results » de la façon suivante :Une première partie est essentiellement consacrée aux complexes de ruthénium et d’osmium couplés à la biotine et la 4-(2-aminoethyl)morpholine n’ayant démontré qu’une très faible activité antiproliférative sur un panel de quatre lignées cancéreuses. Cette partie rapporte la synthèse et la caractérisation de six nouveaux complexes de ruthénium et d’osmium, leur évaluation biologique préliminaire ainsi le recours à une approche computationnelle afin de mettre en évidence la « non-réactivité » de ces complexes.La seconde et majeure partie de ce travail est axée sur une étude en profondeur de nos quatre nouveaux complexes portant une chaine alkyl-C16. Ces complexes possèdent à la une importante composante lipophile et une composante ionique leur conférant un caractère mixte en termes de lipophile et d'hydrophile, c'est pourquoi nous avons décidé de les nommer complexes amphiphiles. L'évaluation biologique préliminaire de cette série de complexes amphiphiles a révélé une puissante activité antiproliférative avec des valeurs d'IC50 inférieures à 1 μM sur un panel de lignées cellulaires humaines cancéreuses, ce qui nous a permis de confirmer notre hypothèse originale. Dans le cadre d'un sujet de recherche de chimie médicinale, la suite logique et par extension la plus grande partie de ce travail, a donc été consacrée en grande partie à comprendre les mécanismes et les voies moléculaires impliquées dans l'activité antitumorale de cette série de complexes amphiphiles. Malgré la très grande quantité de complexes de ruthénium et d'osmium reportés depuis plusieurs décennies, les mécanismes cellulaires responsables de l'activité anticancéreuse restent assez vagues et aucun consensus général n'a pu être établi. Après de nombreuses hypothèses établies rationnellement et réfutées expérimentalement, nous avons pu établir nous avons pu établir un potentiel mécanisme d'action lié au métabolisme mitochondrial. Ceci nous a permis de contribuer à notre échelle, à la recherche de la compréhension des mécanismes d'action antiprolifératif des complexes de ruthénium et d'osmium. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les réacteurs de 4ème génération ont pour objectif l’avènement d’un nucléaire durable susceptible de soutenir la transition énergétique. Anticipant un possible retard, dû à des difficultés techniques et économiques, des solutions innovantes inspirées des technologies actuelles (REP) sont à l’étude. Ces réacteurs à haute conversion nécessitent le développement d’outils académiques simples et robustes adaptés aux phases de la conception et capables :- D’évaluer les performances du combustible (burnup). Cet aspect est géré par l’environnement C++ SMURE (Serpent/MCNP Utility for Reactor Evolution), ici adapté et complété pour modéliser l’évolution du combustible à l’échelle de l’assemblage comme à l’échelle du cœur.- D’évaluer les performances de sûreté, ce qui nécessite le couplage entre la neutronique, ici approximée par la théorie de la diffusion et résolue par la NDM (Nodal Drift Method), et la thermohydraulique dont le traitement est simplifié dans le code BATH (Basic Approach to ThermalHydraulics). Le couplage NDM/BATH a fait l’objet d’une validation sur un benchmark d’éjection de grappe.Nos outils et méthodes de conception sont appliqués au dimensionnement de SMR sous-modérés à eau légère fonctionnant soit au Th/U soit au Th/Pu. Outre les critères usuels de conception (i.e. facteur de forme), il s’est avéré nécessaire, pour la crédibilité du concept, de spécifier la gestion de la réactivité, ce qui a mené au développement d’une méthodologie d’optimisation des poisons consommables. L’analyse de sûreté a permis de poser de nouveaux critères de conception, notamment sur le niveau maximal de sous-modération permettant d’éviter la crise d’ébullition nucléée. Cela a également mis en lumière les implications sur la sûreté de certains choix de conception comme le fonctionnement avec un inventaire réduit en bore soluble. / The Generation IV of nuclear reactors aims at making the nuclear energy a sustainable power source, able to contribute efficiently to the energetic transition. To anticipate the delay of this Gen. IV, innovative retro-fitted nuclear reactors with high level of conversion are studied. The conception of such reactors needs the development of a flexible and robust academical tool box in order to:- Evaluate fuel performance. This is done by means of SMURE (Serpent/MCNP Utility for Reactor Evolution), the dedicated CNRS C++ framework, which is adapted to perform burnup calculation both at assembly scale and at core scale.- Evaluate safety performance. This implies coupled transient simulation between neutronics and thermohydraulics. Neutronics is handled by the Nodal Drift Method (NDM) which solves the diffusion equations while thermohydraulics is simplified and computed by the code Basic Approach to ThermalHydraulics (BATH). This coupling between NDM/BATH has been validated on a Rod Ejection Accident (REA) benchmark.Ours tools and methods are applied on the design of sub-moderated water-cooled SMR cores using either Th/U or Th/Pu fuel. In addition to basic conception criteria such as the form factor, the reactivity management has been investigated in details, which has led to the development of a new methodology for optimal used of burnable poisons. The safety analysis against REA highlights new conceptions limits, in particular on the maximal sub-moderating ratio in order to avoid nucleate boiling. It also reveals the consequences on the reactor safety of some design choices such as low soluble boron inventory.

CARACTERISATION IN VITRO ET IN VIVO DE NOUVEAUX AGENTS PYRROLO-PYRIMIDINE CIBLANT LES MICROTUBULES POUR LE TRAITEMENT DES CANCERSEn dépit de l’émergence des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la chimiothérapie reste un gold-standard pour le traitement de nombreux cancers. Parmi les agents chimiothérapeutiques conventionnels, les poisons du fuseau interférant avec la dynamique des microtubules (taxanes, vinca-alcaloïdes) sont très largement utilisés. Cependant, leurs nombreux effets indésirables et l’émergence de chimiorésistance limitent leur efficacité et soulignent la nécessité d’identifier de nouveaux inhibiteurs de la tubuline.Notre équipe a réalisé un criblage cellulaire à haut-débit sur plus de 7500 molécules chimiques et identifié une famille de composés pyrrolo-pyrimidine, active sur les formes de cancer pulmonaire résistantes à l’apoptose et aux thérapies ciblées. Notre objectif était de caractériser in vitro et in vivo 15 molécules de cette famille afin d’identifier à terme un potentiel candidat-médicament pour le traitement des cancers résistants.Des essais préliminaires de cytotoxicité et d’apoptose sur différentes lignées cancéreuses pulmonaires ont permis de sélectionner, parmi les 15 composés pyrrolo-pyrimidine, 2 molécules prometteuses : PP-2 et PP-13. PP-2 et PP-13 ont des effets cytotoxiques sur de nombreuses lignées cancéreuses humaines, incluant les lignées résistantes aux thérapies ciblées. En perturbant l’organisation et la dynamique des microtubules, PP-2 et PP-13 induisent le blocage transitoire des cellules en prométaphase puis aboutissent aux phénomènes de catastrophe mitotique, de glissement mitotique ou de division asymétrique. Des études mécanistiques avancées montrent que PP-2 et PP-13 sont des agents poisons du fuseau et entrent en compétition avec la colchicine pour la liaison sur la tubuline. Contrairement aux antimitotiques conventionnels, PP-2 et PP-13 ne sont pas sensibles aux mécanismes de chimiorésistance par surexpression de pompes d’efflux. De plus, à l’IC50, ces 2 composés n’affectent pas le réseau microtubulaire des cellules à l’interphase suggérant un effet toxique (et principalement neurotoxique) moindre. La molécule PP-13 semble être la molécule anticancéreuse la plus prometteuse en raison de son IC50 10 fois inférieure à celle de PP-2 dans les différentes lignées cancéreuses étudiées et d’une affinité pour la tubuline 2 fois plus élevée. In vivo, PP-13 réduit significativement la croissance tumorale et étastatique. L’ensemble de ces résultats suggère que PP-13 pourrait être une alternative intéressante pour le traitement de nombreux cancers y compris des cancers chimiorésistants. / CHARACTERIZATION OF NEW MICROTUBULE-TARGETING AGENTS WITH A PYRROLO-PYRIMIDINE STRUCTURE FOR THE TREATMENT OF CANCERSDespite the emergence of targeted therapies and immunotherapy, chemotherapy remains a gold-standard for the treatment of numerous malignancies. Spindle poisons that interfere with microtubule dynamics (taxanes, vinca alkaloids) are commonly used in chemotherapy drug combinations. However, their troublesome side effects and the emergence of resistance highlight the need for identifying alternative agents. Thanks to a high throughput cell-based assay, we screened agents able to restore apoptosis in apoptosis-resistant lung cancer cells. We selected 15 molecules belonging to the pyrrolopyrimidine family and investigated their anti-cancer effects in vitro and in vivo. Our aim was to identify a potential drug-candidate for the treatment of resistant cancers.From cytotoxicity and apoptosis preliminary assays, we selected the 2 most promising molecules (PP-2, PP-13) among the 15 pyrrolopyrimidine compounds. PP-2 and PP-13 exert cytotoxic effects on a large panel of human cancer cell lines, including targeted therapy-resistant cell lines. By interfering with mitotic spindle organization and microtubule dynamics, PP-2 and PP-13 impair the congression of the chromosomes, promote spindle assembly checkpoint-dependent mitotic blockade and finally lead to asymmetric division, mitotic slippage and direct apoptotic death. PP-2 and PP-13 directly target tubulin and compete with colchicine for the binding to tubulin. Unlike conventional antimitotic agents, PP-2 and PP-13 are not sensitive to chemoresistance mechanisms involving the overexpression of efflux pumps. Moreover, at IC50, these two compounds do not affect the microtubule network during interphase suggesting a less toxic (mainly neurotoxic) effect. Among these two compounds, the PP-13 molecule appears to be the most interesting anti-cancer molecule because of its IC50 10-fold lower than PP-2 and its 2-fold higher affinity for tubulin. In vivo, PP-13 significantly reduces tumor and metastasis growth. All these results suggest that PP-13 might be a potential alternative for the treatment of many cancers including chemoresistant cancers.