Le traitement de pathologies cardiaques ischémiques est limité par labsence de capacité régénérative du myocarde. Plusieurs études ont suggéré le potentiel de régénération du myocarde des cellules souches hématopoïétiques (CSH), mésenchymateuses (CSM) et des cellules progénitrices endothéliales (CPE). Une des stratégies envisageables en thérapie cellulaire est la mobilisation des cellules souches adultes de moelle osseuse (MO) dans le sang périphérique (SP) afin quelles puissent participer aux phénomènes de réparation tissulaire cardiaque. Le G-CSF est une cytokine puissante dont il a été démontré quelle pouvait améliorer la fonction et la perfusion cardiaque après un infarctus du myocarde, non seulement en mobilisant les cellules souches de la MO, mais également, en exerçant des effets cardioprotecteurs directs. Toutefois, des études complémentaires sont requises afin de clarifier lintérêt dun traitement complémentaire par du G-CSF chez les patients souffrant dinfarctus aigu du myocarde. Lobjectif du travail est dévaluer plus précisément la capacité du G-CSF à mobiliser les CSH, les CSM et les CPE et dexaminer la contribution de ces cellules aux phénomènes de réparation tissulaire cardiaque après infarctus du myocarde. Evaluation de la taille de linfarctus chez la souris par µSpect Les modèles murins sont fréquemment utilisés pour étudier les mécanismes physiopathologiques cardiaques et tester les nouvelles stratégies thérapeutiques ; toutefois, lévaluation de la fonction cardiaque reste plus difficile daccès que chez les gros animaux. Cest la raison pour laquelle nous avons mis au point un modèle dinfarctus du myocarde (IM) par occlusion de lartère coronaire chez la souris, mais également les techniques nécessaires à lexploration de la perfusion et de la fonction cardiaque. Afin de suivre lévolution des paramètres hémodynamiques cardiaques fins dans notre modèle dIM, nous avons adapté les techniques déchocardiographie et de sonde à conductance pour leur usage chez la souris. Nous avons ensuite démontré que la technique du µSpect est réalisable chez la souris et permet une détermination précise de la taille de linfarctus. En effet, vu les très petites dimensions du cur de souris, nous avions besoin dune résolution spatiale élevée que nous offre le nouveau système de Spect (Linoview Spect) : celui-ci peut en effet différencier deux points éloignés de 0,35mm. Nous obtenons effectivement des images de qualité équivalente à celles obtenues dans les études cliniques humaines. Nous avons validé cette technique en démontrant une excellente corrélation entre la taille de la zone ischémiée mesurée par µSpect et celle obtenue par les techniques histologiques de coloration au TTC ou trichrome. Nous avons également observé un faible taux de variation des valeurs inter-observation ou inter-observateur. Mobilisation des cellules progénitrices par du G-CSF chez des animaux sains Avant dévaluer la contribution du G-CSF aux phénomènes de réparation du tissu cardiaque lésé suite à une diminution de la perfusion, nous avons tout dabord étudié la capacité du G-CSF à mobiliser les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH), mésenchymateuses (CPM) et endothéliales (CPE). Nous voulions également vérifier limpact dun traitement par du G-CSF sur la perfusion ainsi que sur les performances du muscle cardiaque normal. Nous avons démontré que l'administration de G-CSF chez les souris induit la mobilisation en périphérie de CPH, CPM et CPE, selon une cinétique spécifique à chaque type de cellules progénitrices. Cest après trois jours de traitement par du G-CSF que nous observons un nombre maximum des trois types de progéniteurs dans la SP ; ce serait donc le jour le plus approprié pour collecter par aphérèse une population enrichie en CPH, CPM et CPE. Toutefois, ce jour de collecte est à adapter spécifiquement à chaque type de cellules progénitrices. Lanalyse échocardiographique et les mesures de pression-volume ont démontré que l'administration de G-CSF a un impact sur la fonction hémodynamique cardiaque. Ces données hémodynamiques ont révélé une relaxation anormale du cur, une compliance plus faible du ventricule gauche (VG) et une plus faible déformation du myocarde. Ces résultats pourraient suggérer que le G-CSF exerce un effet rigidifiant sur les parois ventriculaires. De plus, limagerie µSpect montre que la perfusion myocardique chez des souris saines est augmentée de façon importante, peu de temps après l'administration de G-CSF. Mobilisation des cellules progénitrices après la survenue dun IM Nous avons examiné si la survenue dun IM pouvait affecter le nombre de progéniteurs dans la moelle osseuse et le sang périphérique. Nous avons observé que le nombre de CPH et de CFU-GM diminue aussi bien dans la moelle quen circulation, probablement en conséquence de l'inhibition post-inflammatoire de l'hématopoïèse. Les nombres de CPM et la CPE de la moelle ne varient pas, tandis que les CFU-F formées à partir des cellules médullaires diminuent. Ces trois paramètres augmentent considérablement dans le SP, indiquant une mobilisation importante de ces cellules progénitrices, en réponse à l'inflammation myocardique. Il apparaît clairement que les cellules progénitrices sont spécifiquement mobilisées suite à lIM et non pas chez les « sham-operated animals », alors que ces derniers subissent lentièreté de la chirurgie, à lexception de la ligature de lartère coronaire. Mobilisation des cellules progénitrices par du G-CSF chez des animaux souffrant dIM Nous avons étudié la contribution du G-CSF à la réparation du tissu cardiaque dans notre modèle murin de ligature de lartère coronaire. Limpact sur la survie, la fonction hémodynamique cardiaque et la perfusion, de 2 timings de traitement par du G-CSF a été étudiée par lusage complémentaire de léchographie, lévaluation hémodynamique à partir de boucle pression-volume et limagerie µSpect. Pour ce faire, les animaux ligaturés sont traités par du G-CSF, soit pendant 5 jours après linfarctus, soit pendant 5J avant et 5J après la chirurgie. Une semaine après linduction de lIM, les modifications fonctionnelles et structurelles induites par linfarctus et le traitement au G-CSF sont évaluées. Les résultats que nous avons obtenus montrent que les CPM et les CPE sont davantage mobilisées dans le sang périphérique chez les souris souffrant dIM et traitées par du G-CSF que chez les animaux non traités. De plus, ladministration du G-CSF est nécessaire à la mobilisation des CPH après un IM aigu. Ladministration de G-CSF améliore la survie des animaux. En effet, la mortalité évolue de 30% chez les animaux non traités à 18% chez les animaux traités par du G-CSF dans les 5J qui suivent la ligature, et 0% de survie si les animaux sont traités 5J avant la ligature et 5J après. Le remodelage du VG est également amélioré par le G-CSF, comme le montre la diminution du poids du coeur et de la taille du VG. Nous avons alors évalué l'impact de l'administration de G-CSF sur le déficit de la perfusion et avons observé que ce paramètre, ainsi que la taille de linfarctus, sont sensiblement diminués après 10 jours de G-CSF. Nous obtenons également une évolution favorable de la perfusion entre les jours 1 et 7 chez les animaux recevant du G-CSF. Le nombre d'artérioles CD31 positives dans le coeur est également augmenté après un traitement par du G-CSF. Afin dévaluer plus précisément l'impact du traitement par du G-CSF sur la physiopathologie cardiaque chez des souris souffrant dIM, une évaluation hémodynamique de fonction cardiaque a été réalisée. Nous pouvons observer une amélioration de certains paramètres de la fonction cardiaque mais non de tous. En effet, 7 jours après la survenue de lIM, le débit cardiaque est presque totalement corrigé mais la fraction déjection du VG reste inchangée. Les paramètres de déformation du VG ne sont pas normalisés une semaine après linfarctus. Dun point de vue hémodynamique, la constante de relaxation augmente au-delà des valeurs normales après ladministration de G-CSF. De même, en fin de diastole, la pression augmente fortement, alors que le volume reste inchangé. Ces données indiquent à nouveau une altération de la relaxation du muscle cardiaque et une diminution de la compliance du VG chez les animaux traités par du G-CSF. Ces résultats confirment le potentiel du G-CSF à mobiliser les cellules progénitrices dans le sang périphérique et leur possible contribution aux phénomènes de réparation cardiaque. Le développement dun traitement par du G-CSF dans les pathologies ischémiques cardiaques est un thérapeutique non invasive qui suscite un vif intérêt, mais qui nécessite des évaluations approfondies au travers détudes fondamentales et cliniques en double aveugle et randomisées. Il faut maintenant déterminer les mécanismes par lesquels le G-CSF exer

Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales. / Central nervous system (CNS) development in vertebrates is an extremely complex process that requires tight molecular control. Some very early expressed genes during embryonic development are of tremendous importance for CNS development. Among those, we find the LIM homeodomain protein Lhx2. Embryos that lack Lhx2 (Lhx2-/-) suffer from cerebral cortex hypoplasia, are anophtalmic and have smaller liver. The mutant embryos die in utero at embryonic day 16 (e16) due to a deficit in mature erythrocytes. The principal objective of this thesis was to characterize the molecular function of Lhx2 in eye and cerebral cortex development. Lhx2 is a part of the homeodomain transcription factors expressed in the anterior neural plate along with Rx, Pax6 and Six3. Eye development starts by a bilateral evagination of this region. We show here that Lhx2 expression is crucial for the first steps of eye formation. Indeed, in absence of Lhx2, Rx, Six3 and Pax6 expression is delayed in the anterior neural plate. At the optic vesicle stage, Lhx2 mutation precludes the initiation of Six6 expression (an homeodomain transcription factor essential for eye development). We demonstrate that Lhx2 and Pax6 bind to Six6 promoter and cooperate for its trans‐activation. So, Lhx2 is essential for retinal identity determination in the neural plate. Later on, it cooperates with Pax6 to establish definitive retinal identity and promote cell proliferation. Lhx2 is strongly express in the telencephalon, the embryonic region that will give rise to cerebral cortex. Lhx2 ablation causes a decrease in neural progenitor cells proliferation in this region. We show that the lack of Lhx2 causes a premature differentiation of the radial glia cells into intermediate progenitors and post‐mitotic neurons. These phenotypes correlate with a decrease activity of the Notch pathway. In Lhx2-/- telencephalon, the atypical Notch‐ligand DNER is strongly overexpressed. Furthermore, Lhx2 and co‐repressors associate at the DNER promoter region. We conclude that Lhx2 allows Notch pathway activation in the developing cerebral cortex. It does so by inhibiting DNER transcription, which is a Notch pathway repressor in this particular context. Thus, Lhx2 allows the maintenance and the proliferation of neural progenitor cells.

Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales. / Central nervous system (CNS) development in vertebrates is an extremely complex process that requires tight molecular control. Some very early expressed genes during embryonic development are of tremendous importance for CNS development. Among those, we find the LIM homeodomain protein Lhx2. Embryos that lack Lhx2 (Lhx2-/-) suffer from cerebral cortex hypoplasia, are anophtalmic and have smaller liver. The mutant embryos die in utero at embryonic day 16 (e16) due to a deficit in mature erythrocytes. The principal objective of this thesis was to characterize the molecular function of Lhx2 in eye and cerebral cortex development. Lhx2 is a part of the homeodomain transcription factors expressed in the anterior neural plate along with Rx, Pax6 and Six3. Eye development starts by a bilateral evagination of this region. We show here that Lhx2 expression is crucial for the first steps of eye formation. Indeed, in absence of Lhx2, Rx, Six3 and Pax6 expression is delayed in the anterior neural plate. At the optic vesicle stage, Lhx2 mutation precludes the initiation of Six6 expression (an homeodomain transcription factor essential for eye development). We demonstrate that Lhx2 and Pax6 bind to Six6 promoter and cooperate for its trans‐activation. So, Lhx2 is essential for retinal identity determination in the neural plate. Later on, it cooperates with Pax6 to establish definitive retinal identity and promote cell proliferation. Lhx2 is strongly express in the telencephalon, the embryonic region that will give rise to cerebral cortex. Lhx2 ablation causes a decrease in neural progenitor cells proliferation in this region. We show that the lack of Lhx2 causes a premature differentiation of the radial glia cells into intermediate progenitors and post‐mitotic neurons. These phenotypes correlate with a decrease activity of the Notch pathway. In Lhx2-/- telencephalon, the atypical Notch‐ligand DNER is strongly overexpressed. Furthermore, Lhx2 and co‐repressors associate at the DNER promoter region. We conclude that Lhx2 allows Notch pathway activation in the developing cerebral cortex. It does so by inhibiting DNER transcription, which is a Notch pathway repressor in this particular context. Thus, Lhx2 allows the maintenance and the proliferation of neural progenitor cells.

Une partie du cœur est formée à partir des cellules progénitrices du second champ cardiaque, qui permettent une élongation rapide du tube cardiaque. Des défauts dans le développement de ces cellules entrainent des malformations cardiaques congénitales. Ces cellules sont localisées dans le péricarde dorsal au sein du mésoderme pharyngé. Mon travail de thèse a permis de démontrer pour la première fois que ces cellules sont épithéliales et polarisées, et qu’elles forment des filopodes dynamiques du côté basal. La délétion du facteur de transcription Tbx1 perturbe la polarité des cellules et la formation des filopodes, et augmente le niveau de la protéine apicale aPKCζ. Le traitement avec un activateur de aPKCζ montre le lien entre l’intégrité épithéliale, la polarité et la formation des filopodes, et l’état progéniteur des cellules. J’ai également analysé la polarité planaire dans l’épithélium, et montrais que les cellules sont anisotropiques, étirées et allongées en direction du pole artériel. Cet étirement crée une tension orientée, révélée par une accumulation polarisée d’actomyosine, jouant le rôle de rétrocontrôle négatif. En absence d‘élongation du tube cardiaque cette tension orientée est absente. Nous avons identifié une région postérieure de l’épithélium où se trouvent une tension et une prolifération élevées, ainsi qu’une forte activité YAP/TAZ qui jouerait le rôle de relai entre tension et prolifération. La tension orientée oriente les divisions cellulaires et oriente ainsi la croissance du tissu, promouvant l’addition des cellules au pole artériel. La biomécanique des cellules du second champ cardiaque semble ainsi un moteur important pour l’élongation du cœur. / A major part of the heart is formed by progenitor cells called the second heart field, that contribute to rapid elongation of the heart tube. Defects in second heart field development leads to congenital heart malformations. Second heart field cells are localised in pharyngeal mesoderm in the dorsal pericardial wall. This study focuses on the epithelial properties of second heart field cells and first shows that these progenitors in the dorsal pericardial wall are epithelial and polarised, and form dynamic basal filopodia. Deletion of the transcription factor Tbx1 perturbs epithelial polarity and filopodia formation and upregulates the apical determinant aPKCζ. Treatment with an activator of aPKCζ reveals that epithelial integrity, polarity and basal filopodia are coupled to the progenitor status of second heart field cells. Next we evaluated planar polarity of second heart field cells in the dorsal pericardial wall. Cells are anisotropic, being stretched and elongated on an axis directed towards the arterial pole. This stretch results in oriented epithelial tension revealed by polarised actomyosin accumulation through a negative feedback loop. In the absence of cell addition to the cardiac poles oriented tension is absent. We identified a posterior region in the epithelium with high tension, elevated proliferation and a high level of active YAP/TAZ that may act as relay between tension and proliferation. Oriented tension orients the axis of cell division and the growth of the tissue on an axis toward the arterial pole, further promoting addition of the tissue to the pole. Biomechanical feedback may thus be an important driver of heart tube elongation.