O foco do trabalho está direcionado para a construção da linhagem knock-out do gene ncsA de A. fumigatus, bem como a caracterização do fenótipo da linhagem DncsA e a investigação de interações deste gene com vias de sinalização importantes para o desenvolvimento do fungo. A linhagem mutante ncsA foi construída através da transformação do WT (Dku80) com o gene marcador pyrG de A. fumigatus. Foi confirmada a deleção por Southern blot e as alterações fenotípicas da linhagem foram analisadas. O gene ncsA em A. fumigatus não é essencial e a linhagem DncsA apresentou-se sensível EGTA e SDS, alé, de tolerante a altas concentrações de íons cálcio. Na linhagem NcsA:mRFP foi localizado a proteína NcsA no citoplasma das células e sua localização não é alterada pela em resposta ao aumento da concentração de cálcio. A linhagem DncsA foi sensível a drogas que afetam a biossíntese e a manutenção da membrana plasmática, tais como voriconazole, anfotericina e itraconazole. O crescimento polarizado em presença de lovastatina nessa linhagem foi consideravelmente mais afetado que no tipo selvagem. O Spitzenkörper não foi visualizado no mutante DncsA, e existe uma significante diminuição de estruturas vacuolares e endossomos. Os resultados obtidos em ensaios de TRPCR em tempo real sugerem que NcsA modula a expressão dos genes pmcA e pmcB, que codificam proteínas ATPases transportadoras de íons cálcio. Os ensaios de virulência no modelo animal revelaram que a mutação do gene ncsA não causa perda de virulência no A. fumigatus. / Here, we characterize the A. fumigatus Neuronal Calcium Sensor, ncsA homologue. We showed that ncsA is not an essential gene and ncsA growth was decreased in the presence of EGTA and SDS. Furthermore, the ncsA mutant is more resistant to calcium chloride. NcsA:mRFP localizes to the cytoplasm that its cellular localization is not affected by the cellular response to calcium chloride. The ncsA mutant strain is more sensitive to voriconazole, itraconazole, and the ergosterol intercalating agent, amphotericin. Polar growth in the DncsA mutant strain was also considerably more affected by lovastatin than in the wild type mutant strain. The Spitzenkörper cannot be visualized in the DncsA mutant, and there is a significant decrease of the endosome/vacuole structures. NcsA supports pmcA and pmcB expression therefore reduced expression of these ion pumps, and also of other genes involved in the response to calcium in A. fumigatus. The ncsA inactivation mutation is not causing loss of virulence in a low dose murine infection when compared to the corresponding wild type strain.

O foco do trabalho está direcionado para a construção da linhagem knock-out do gene ncsA de A. fumigatus, bem como a caracterização do fenótipo da linhagem DncsA e a investigação de interações deste gene com vias de sinalização importantes para o desenvolvimento do fungo. A linhagem mutante ncsA foi construída através da transformação do WT (Dku80) com o gene marcador pyrG de A. fumigatus. Foi confirmada a deleção por Southern blot e as alterações fenotípicas da linhagem foram analisadas. O gene ncsA em A. fumigatus não é essencial e a linhagem DncsA apresentou-se sensível EGTA e SDS, alé, de tolerante a altas concentrações de íons cálcio. Na linhagem NcsA:mRFP foi localizado a proteína NcsA no citoplasma das células e sua localização não é alterada pela em resposta ao aumento da concentração de cálcio. A linhagem DncsA foi sensível a drogas que afetam a biossíntese e a manutenção da membrana plasmática, tais como voriconazole, anfotericina e itraconazole. O crescimento polarizado em presença de lovastatina nessa linhagem foi consideravelmente mais afetado que no tipo selvagem. O Spitzenkörper não foi visualizado no mutante DncsA, e existe uma significante diminuição de estruturas vacuolares e endossomos. Os resultados obtidos em ensaios de TRPCR em tempo real sugerem que NcsA modula a expressão dos genes pmcA e pmcB, que codificam proteínas ATPases transportadoras de íons cálcio. Os ensaios de virulência no modelo animal revelaram que a mutação do gene ncsA não causa perda de virulência no A. fumigatus. / Here, we characterize the A. fumigatus Neuronal Calcium Sensor, ncsA homologue. We showed that ncsA is not an essential gene and ncsA growth was decreased in the presence of EGTA and SDS. Furthermore, the ncsA mutant is more resistant to calcium chloride. NcsA:mRFP localizes to the cytoplasm that its cellular localization is not affected by the cellular response to calcium chloride. The ncsA mutant strain is more sensitive to voriconazole, itraconazole, and the ergosterol intercalating agent, amphotericin. Polar growth in the DncsA mutant strain was also considerably more affected by lovastatin than in the wild type mutant strain. The Spitzenkörper cannot be visualized in the DncsA mutant, and there is a significant decrease of the endosome/vacuole structures. NcsA supports pmcA and pmcB expression therefore reduced expression of these ion pumps, and also of other genes involved in the response to calcium in A. fumigatus. The ncsA inactivation mutation is not causing loss of virulence in a low dose murine infection when compared to the corresponding wild type strain.