Bone Morphogenetic proteins (BMPs) belong to transforming growth factor beta (TGF-£]) superfamily. They regulate cell proliferation, cell differentiation, and bone morphogenesis. Previous evidence suggests that BMP-2, as an antagonist of TGF-£], may play an inhibitory role in tissue fibrogenesis. The aim of this study is to examine the expression profile of BMP-2 in fibrotic livers and to test whether BMP-2 gene delivery could alleviate or reverse the liver fibrogenesis models in mice including bile duct ligation (BDL) or carbon tetrachloride (CCl4) model. The results showed that the AST, ALT, and bilirubin levels in sera and the expression of TGF-£], £\-smooth muscle actin, type I collagen in livers were significantly up-regulated by BDL surgery or CCl4 administration. After BDL, the hepatic BMP-2 mRNA and protein levels in mice decreased at 7 and 14 days after surgery. Similarly, the hepatic BMP-2 mRNA and protein levels in mice decreased at day 14 and 28 after CCl4 administration. BMP-2 gene delivery alleviated the inflammation and the liver injury caused by BDL or CCl4 exposure. These findings strongly suggest that BMP-2 is involved in the pathogenesis of liver fibrosis. Moreover, BMP-2 supplementation may facilitate a novel strategy for treatment of liver fibrosis.

The multi-functional FGL2 can be expressed as either a type II membrane-associated glycoprotein or a secreted tetrameric molecule. As an important effector of regulatory T cells, secreted FGL2 inhibits dendritic cell maturation and T cell proliferation. The mechanism of its immunomodulatory function remains unclear. The goals of this thesis are to identify receptor(s) of secreted FGL2, key biological functions and signaling pathways, and mechanism of FGL2 oligomerization. Soluble FGL2 was critical for all studies, and the production of recombinant FGL2 was compared in E. coli, insect cells and mammalian cells. Soluble and stable FGL2 was secreted only by mammalian cells, indicating the importance of post-translational modification. In flow cytometry and surface plasmon resonance assays, recombinant FcFGL2 and albumin tagged FGL2 fusion proteins bound to Fc gamma RIIB and Fc gamma RIII receptors expressed by antigen presenting cells (APCs), including lipopolysaccharide (LPS)-stimulated B lymphocytes, endothelial cells, thioglycollate-stimulated peritoneal macrophages, and bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs). The binding of recombinant FGL2 to Fc gamma RIIB and Fc gamma RIII was specific, dependent on receptor expression and blocked by anti-Fc gamma RIIB/III antibody. FcFGL2 inhibited the maturation of BM-DC derived from fc gamma riib wild type mice but not from fc gamma riib knock out mice. It also induced apoptosis of the A20 mouse B cell line (Fc gammaRIIB+), but not the A20IIA1.6 cell line (Fc gamma RIIB-). The activation of caspases induced by FcFGL2 binding to A20 cells was confirmed by flow cytometry, Western blotting and analysis of DNA fragmentation. The role of Fc gammaRIIB in FGL2-mediated immunosuppression was confirmed in vivo. Infusion of FcFGL2 into fc gamma riib+/+, but not fc gamma riib-/- C57BL/6J mice (H-2b) inhibited the rejection of fully mismatched BALB/cJ (H-2d) skin and heart allografts. Studies on the mechanism of FGL2 oligomerization employed site-directed mutagenesis and revealed that cysteines at positions 94, 97, 184, and 187 were critical. Mutation of these cysteines resulted in secretion of monomeric FGL2. Computer modeling of FGL2 tetramers predicted an asymmetric arrangement that was similar to the structure of multimeric ficolin. The data presented in this thesis provide mechanistic insights into the immunosuppressive activity of soluble FGL2, and a foundation for the development of a novel and potentially highly effective immunosuppressive therapy.

The multi-functional FGL2 can be expressed as either a type II membrane-associated glycoprotein or a secreted tetrameric molecule. As an important effector of regulatory T cells, secreted FGL2 inhibits dendritic cell maturation and T cell proliferation. The mechanism of its immunomodulatory function remains unclear. The goals of this thesis are to identify receptor(s) of secreted FGL2, key biological functions and signaling pathways, and mechanism of FGL2 oligomerization. Soluble FGL2 was critical for all studies, and the production of recombinant FGL2 was compared in E. coli, insect cells and mammalian cells. Soluble and stable FGL2 was secreted only by mammalian cells, indicating the importance of post-translational modification. In flow cytometry and surface plasmon resonance assays, recombinant FcFGL2 and albumin tagged FGL2 fusion proteins bound to Fc gamma RIIB and Fc gamma RIII receptors expressed by antigen presenting cells (APCs), including lipopolysaccharide (LPS)-stimulated B lymphocytes, endothelial cells, thioglycollate-stimulated peritoneal macrophages, and bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs). The binding of recombinant FGL2 to Fc gamma RIIB and Fc gamma RIII was specific, dependent on receptor expression and blocked by anti-Fc gamma RIIB/III antibody. FcFGL2 inhibited the maturation of BM-DC derived from fc gamma riib wild type mice but not from fc gamma riib knock out mice. It also induced apoptosis of the A20 mouse B cell line (Fc gammaRIIB+), but not the A20IIA1.6 cell line (Fc gamma RIIB-). The activation of caspases induced by FcFGL2 binding to A20 cells was confirmed by flow cytometry, Western blotting and analysis of DNA fragmentation. The role of Fc gammaRIIB in FGL2-mediated immunosuppression was confirmed in vivo. Infusion of FcFGL2 into fc gamma riib+/+, but not fc gamma riib-/- C57BL/6J mice (H-2b) inhibited the rejection of fully mismatched BALB/cJ (H-2d) skin and heart allografts. Studies on the mechanism of FGL2 oligomerization employed site-directed mutagenesis and revealed that cysteines at positions 94, 97, 184, and 187 were critical. Mutation of these cysteines resulted in secretion of monomeric FGL2. Computer modeling of FGL2 tetramers predicted an asymmetric arrangement that was similar to the structure of multimeric ficolin. The data presented in this thesis provide mechanistic insights into the immunosuppressive activity of soluble FGL2, and a foundation for the development of a novel and potentially highly effective immunosuppressive therapy.

Methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) was discovered as a protein binding to methylated DNA more than 20 years ago. It is very abundant in the brain and was shown to be able to repress transcription. The mutations in MeCP2 cause Rett syndrome, an autism-spectrum neurological disorder affecting girls. Yet, the exact role of MeCP2 in Rett disease, its function and mechanism of action are not fully elucidated. In order to shed some light on its role in the disease the aim of this project was to identify proteins interacting with MeCP2. Affinity purification of MeCP2 from mouse brains and mass spectrometry analysis revealed new interactions between MeCP2 and protein complexes. Detailed analysis confirmed the findings and narrowed down the top interactions to distinct regions of MeCP2. One of the domains interacts with identified NCoR/SMRT co-repressor complex and is mutated in many patients with Rett syndrome. In vitro assays proved that these mutations abolish the putative transcriptional repressor function of MeCP2. We propose a model in which Rett syndrome is caused by two types of mutations: either disrupting the interaction with DNA or affecting the interaction with the identified complex, which has an effect on the global state of chromatin. The presented findings can help to develop new therapies for Rett syndrome in the future.

Because of its high specific strength, durability, and biocompatibility, titanium is a widely used material for orthopedic implants. However, its insufficient binding with the surrounding bone tissue regularly leads to stress shielding, bone resorption and implant loosening. A promising solution to improve adhesion is to modify the implant surface chemistry and topography by coating it with a protein-eluting polyelectrolyte complex. Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), a potent osteoconductive growth factor, was adsorbed onto the surface of anodized titanium, and polyelectrolyte multilayer (PEM) coatings prepared from solutions of poly-L-histidine (PLH) and poly(methacrylic acid) (PMAA) were built on top of the BMP-2. The effect of solution pH during the deposition process was investigated. High levels of BMP-2 released over several months were achieved. Approximately 2 μg/cm² of BMP-2 were initially adsorbed on the anodized titanium and a pH-dependent release behavior was observed, with more stable coatings assembled at pH = 6-7. Three different diffusion regimes could be determined from the release profiles: an initial burst release, a sustained release regime and a depletion regime. Mass adsorption monitoring using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) showed that PLH was adsorbed in greater quantities than PMAA, and that more mass was adsorbed per bilayer as the number of bilayers grew. Moreover, the pH of the water used during the rinsing step significantly impacted the composition of the multilayer. Atomic force microscopy (AFM) and contact angle analysis (CAA) were used to determine the topography and surface energy of the PEMs. No visible change was observed in surface morphology as the assembly pH was varied, whereas the surface energy decreased for samples prepared at more basic pH. These variations indicate that the influence of the initial BMP-2 layer can be felt throughout the PEM and impact its surface structure.

Einleitung Fokale Gelenkknorpeldefekte treten in der Deutschen Bevölkerung mit einer geschätzten Inzidenz von über 300 000 jährlichen Fällen auf. In der US-amerikanischen Bevölkerung wird jährlich von über 600 000 Fällen ausgegangen. Aufgrund der Insuffizienz körpereigener Heilungskapazitäten und verfügbarer Therapieverfahren, schreitet die Erkrankung regelhaft zur post-traumatischen Arthrose fort. Neben der individuellen Lebensqualitätseinschränkung besteht eine sozioökonomische Bedeutung mit geschätzten Krankheitskosten von jährlich über 10 Milliarden US Dollar in den Vereinigten Staaten. Das Versagen zellbasierter Therapieverfahren beruht unter anderem auf einer Insuffizienz der chondrogenen Differenzierung, sowie der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten mit nachfolgender Osteogenese analog den Vorgängen in der Wachstumsfuge. Für die Induktion der chondrogenen Differenzierung stehen insbesondere Mitglieder der TGF-β Superfamilie, wie BMP-2, zur Verfügung. Diese sind jedoch ebenso durch eine Induktion der hypertrophen Differenzierung gekennzeichnet. Zur Induktion der Chondrogenese unter Umgehung der TGF-β-Signalwege wurde IHH in-vitro als vielversprechend beschrieben. Bislang besteht jedoch kein Nachweis der in-vivo Effektivität von IHH zur Knorpelreparation. Die Schaffung eines Wachstumsfaktor-Milieus in der Gelenkknorpelläsion in-vivo stellt ebenso eine Herausforderung dar. Diesbezüglich wurde ein vereinfachtes Verfahren zum lokalisierten in-vivo Gentransfer mittels adenoviraler Vektoren und autologen Knochenmarkskoagulaten anhand von Markergenen beschrieben. Die Effektivität jenes Verfahrens zur in-vivo Knorpelreparation wurde noch nicht gezeigt. Zweck dieses kontrollierten in-vivo Experimentes ist es, mittels des oben genannten Gentransferverfahrens die Wirksamkeit von BMP-2 und IHH zur Reparation von osteochondralen Defekten in New Zealand White Rabbits nachzuweisen. Die zentrale Hypothese lautete, dass BMP2 beziehungsweise IHH Gentransfer in einer höheren langzeit-histologischen Qualität des Reparationsgewebes resultiert. Explorativ sollten dabei Unterschiede in den einzelnen Dimensionen der Gewebequalität anhand des ICRS-II Histology Scoring Systems, sowie der Grad der Typ I (als Faserknorpelmarker), Typ II (als Marker hyalinen Gelenkknorpels) und Typ X Kollagen Deposition (als Marker hypertropher Chondrozyten) beschrieben werden. Material und Methoden Als Tiermodel wurden bilaterale 3,2 mm durchmessende osteochondrale Bohrlochdefekte in der Trochlea von New Zealand White Rabbits verwendet (n=10 unabhängige Tiere, 20 Gelenke). Die Defekte wurden mit autologen Knochenmarkkoageln gefüllt, die nach vorheriger Beckenkammaspiration gewonnen wurden. In den experimentellen Gruppen wurden die Knochenmarkkoagel beladen mit jeweils 1 x 1011 infektiösen Partikeln adenoviraler Vektoren, die cDNA codierend für BMP2 (n=3 Tiere, entsprechend 6 Gelenken) oder IHH (n=4; 8) enthielten. In der Kontrollgruppe wurde das nicht-chondrogene Markergen GFP (n=3; 6) transferiert. Beide Gelenke eines Tieres wurden der gleichen Gruppe zugeordnet. Die histologische Gewebequalität wurde nach 13 Wochen anhand des ICRS-II Scoringsystems durch 3 unabhängige, verblindete Untersucher bewertet. Als primäre Outcomes wurden der ICRS-II Parameter „Generelles Assessment“, sowie die Typ II Kollagen positive Fläche designiert. Als explorative Outcomes wurden die verbleibenden ICRS-II Parameter, sowie die Typ I und Typ X Kollagen Deposition bewertet. Die Korrelation zwischen den Untersuchern wurde nach Pearson ermittelt. Zum Test auf Signifikanz der Gruppenunterschiede wurde ein lineares gemischtes Modell verwendet, welches einer mögliche Abhängigkeit beider Gelenke eines Tieres Rechnung trägt. Ergebnisse Qualitative Bewertung des Reparationsknorpels. Dreizehn Wochen nach der Intervention zeigten die meisten der BMP-2 behandelten Gelenke (4 von 6) und alle der IHH behandelten Gelenke (8 von 8) hyalin-artigen Reparationsknorpel, während alle GFP behandelten Kontrollgelenke (6 von 6) faserknorpel-artiges Reparationsgewebe zeigten. Zwei BMP-2 behandelten Gelenke zeigten eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation. Primäre Outcomes - ICRS-II „Generelles Assessment“ und Typ II Kollagen positive Fläche. IHH und BMP-2 behandelte Gelenke zeigten im Vergleich zu GFP höhere Punktzahlen in dem ICRS-II „Generelles Assessment“ Parameter: +33.0 (95% Konfidenzintervall: -0.4, +66.4) Punkte für IHH und +8.5 (-26.6, +43.7) Punkte für BMP-2. Beide Effekte erreichten nicht das Level statistischer Signifikanz (p=0.052 und 0.537). IHH erhöhte die Typ II Kollagen Deposition in der Defektregion, während BMP-2 Gelenke keinen Unterschied zu GFP Kontrollen zeigten: +18.7 (-4.5, +42.0) Punkte für IHH und +0.0 (-29.7, +29.8) Punkte für BMP-2. Die erhöhte Typ II Kollagendeposition erreichte nicht das konventionelle Level statistischer Signifikanz (p=0.093). Sekundäre Outcomes - ICRS-II Parameter. In dem Vergleich von BMP-2 mit GFP Kontrollen wurde in keinem der 12 untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied festgestellt. IHH Gentransfer resultierte hingegen in höheren Punktzahlen in allen untersuchten Parametern, wobei der Unterschied in 5 der 12 Parameter das Niveau statistischer Signifikanz erreichte. Ein um 21.5 Punkte (+3.6, +39.4) erhöhter Score wurde für den Parameter „Gewebemorphologie“ beobachtet, sowie +21.0 (+6.4, +35.7) für „Chondrozytäres Clustering“, +31.2 (+0.8, +61.5) für „Formation der Tidemark“, +17.3 (+0.2, +34.5) für „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und +35.0 (+4.6, +65.2) für das „Assessment der mittleren und tiefen Zone“. Sekundäre Outcomes - Marker chondrozytärer Hypertrophie. Eine perizelluläre Deposition von Typ X Kollagen wurde in allen Gruppen beobachtet. Eine deutlich gesteigerte Deposition wurde nur in den Gelenken beobachtet, die nach BMP2 Gentransfer eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation zeigten. Diskussion Das hier beschriebene Experiment stellt die erste Veröffentlichung der Wirksamkeit von IHH zur Verbesserung der histologischen Knorpelqualität von in-vivo therapierten Gelenkknorpeldefekten dar [175]. Die Hypothese, dass IHH zu einer verbesserten histologischen Knorpelqualität führt wurde bestätigt, während die Hypothese zu den positiven Effekten von BMP-2 wiederlegt wurde. IHH führte zu besseren Ergebnissen in allen Untersuchten Parametern, das Niveau statistischer Signifikanz wurde dabei in den Parametern „Gewebemorphologie“, „Chondrozytäres Clustering“, „Formation der Tidemark“, „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und „Assessment der mittleren und tiefen Zone“ erreicht. Das primäre Ziel dieses Experimentes war es, den „Proof of concept“ zu liefern, dass IHH auch in-vivo ein attraktiver Faktor für die Induktion der Chondrogenese darstellt. Das langfristige Ziel ist die Induktion der Chondrogenese unter Umgehung des TGF-β Signalweges zu erzielen, um eine folgende hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und die folgende Ossifikation des reparierten Defektes zu verhindern. Die Limitationen der Studie umfassen die ausschließlich histologische und immunhistochemische durchgeführte Bewertung der Knorpelqualität und eine eingeschränkte statistische Power. Ob IHH es vermag die hypertrophe Differenzierung zu umgehen und somit eine langfristige hyaline Knorpelreparation zu ermöglichen, ist in weiteren präklinischen Studien mit biochemischer und molekulargenetischer Analyse der Hypertrophie-Marker zu untersuchen. In Bezug auf den klinischen Einsatz zur Knorpelreparation erscheint der Einsatz der Wachstumsfaktoren als Protein auf funktionalisierten Matrices vielversprechend. BMP-2 wird aufgrund der hier beobachteten intraläsionalen Knochenformation nach BMP2 Gentransfer als nicht geeignet zur Unterstützung der Knorpelreparation in-vivo bewertet. / Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2, encoded by BMP2) and Indian hedgehog protein (IHH, encoded by IHH) are well known regulators of chondrogenesis and chondrogenic hypertrophy. Despite being a potent chondrogenic factor BMP-2 was observed to induce chondrocyte hypertrophy in osteoarthritis (OA), growth plate cartilage and adult mesenchymal stem cells (MSCs). IHH might induce chondrogenic differentiation through different intracellular signalling pathways without inducing subsequent chondrocyte hypertrophy. The primary objective of this study is to test the efficacy of direct BMP2 and IHH gene delivery via bone marrow coagulates to influence histological repair cartilage quality in vivo. Vector-laden autologous bone marrow coagulates with 10^11 adenoviral vector particles encoding BMP2, IHH or the Green fluorescent protein (GFP) were delivered to 3.2 mm osteochondral defects in the trochlea of rabbit knees. After 13 weeks the histological repair cartilage quality was assessed using the International Cartilage Repair Society (ICRS) II scoring system and the type II collagen positive area. IHH treatment resulted in superior histological repair cartilage quality than GFP controls in all of the assessed parameters (with P < 0.05 in five of 14 assessed parameters). Results of BMP2 treatment varied substantially, including severe intralesional bone formation in two of six joints after 13 weeks. In conclusion, IHH gene transfer is effective to improve repair cartilage quality in vivo, whereas BMP2 treatment, carried the risk intralesional bone formation. Therefore IHH protein can be considered as an attractive alternative candidate growth factor for further preclinical research and development towards improved treatments for articular cartilage defects.

Iron homeostasis is regulated by iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2, which bind to iron responsive elements (IRE) in the mRNA of proteins of iron metabolism such as ferritin (iron storage). IRP2 undergoes iron-mediated degradation, and this pathway shares notable similarities with that of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). It has been reported that oxidative stress marked by increased reactive oxygen species (ROS) signal HIF-1 stabilization in hypoxia. The role of ROS in IRP2 regulation is not well-established. We show that the degree of hypoxia induces differential effects on iron-mediated degradation of IRP2, such that IRP2 levels are 3-fold higher when exposed to 0.1% O 2 compared to 3% O2 after 4 hours of iron treatment. Hydrogen peroxide (H2O2) affects IRP2 by inducing IRE-binding activity after 12 hours, which is accompanied by decreased ferritin levels. Furthermore, the ability of H2O2 to protect IRP2 against iron-dependent degradation is similar to that of hypoxia. Finally, both intracellular and extracellular sources of oxidative stress protect IRP2 from ascorbate-mediated degradation. Taken together, these results support a role of ROS in protecting IRP2 against iron-mediated degradation and indicate that oxidative stress modulates downstream effects of IRP2.

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Yes / The activity-regulated cytoskeleton associated protein (Arc/Arg3.1) plays a key role in determining synaptic strength through facilitation of AMPA receptor (AMPAR) endocytosis. Although there is considerable data on the mechanism by which Arc induction controls synaptic plasticity and learning behaviours, several key mechanistic questions remain. Here we review data on the link between Arc expression and the clathrin-mediated endocytic pathway which internalises AMPARs and discuss the significance of Arc binding to the clathrin adaptor protein 2 (AP-2) and to endophilin/dynamin. We consider which AMPAR subunits are selected for Arc-mediated internalisation, implications for synaptic function and consider Arc as a therapeutic target. / The work in S.A.L.C. laboratory is supported by the BBSRC (BB/H018344/1 and BB/J02127X/1) and Wellcome Trust 200646/Z/16/Z. The work in M.J.W. Laboratory is supported by ERUK.