V-ATPasen sind eukaryotische Protonenpumpen, die viele sekundär aktive Transporte energetisieren und eine Reihe von intrazellulären Kompartimenten ansäuern. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Interaktion der V-ATPase aus Manduca sexta mit dem Aktin-Zytoskelett untersucht. Nachdem die Co-Lokalisation der V-ATPase mit F-Aktin in den apikalen Membranen der Gobletzellen immunzytochemisch festgestellt worden war, wurde auch die direkte Wechselwirkung zwischen der V-ATPase und den Aktinfilamenten durch Co-Pelletierungsstudien nachgewiesen. Mit Hilfe von Overlayblots wurde gezeigt, dass sowohl die Untereinheit B als auch Untereinheit C die Bindung an Aktin vermitteln. Co-Pelletierung der Aktinfilamente mit rekombinanter Untereinheit C wiesen eine direkte Interaktion zwischen beiden Proteinen nach. Mit rekombinanter Untereinheit C rekonstituierter V1-Komplex hatte eine deutlich höhere Affinität zu Aktinfilamenten als C-freier V1-Komplex. In Overlayblots wurde nachgewiesen, dass die Untereinheit C beide Formen (F- und G-) des Aktins bindet. Die Interaktion mit G-Aktin wurde mit NBD-markiertem Aktin quantifiziert, wobei sich Dissoziationskonstanten von 50-60 nM ergaben; eine Bevorzugung von ATP-Aktin gegenüber ADP-Aktin oder umgekehrt konnte nicht festgestellt werden. Die Untereinheit C beeinflusste die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts dadurch, dass sie Aktinfilamente unabhängig vom pH stabilisierte und einen positiven Einfluss auf die Vernetzung von Aktinfilamenten hatte. Die auch im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesene Fähigkeit zur Bündelung kann sowohl durch die zwei Aktinbindungsstellen in der Untereinheit C als auch durch ihre Di- und Oligomerisierung unter oxidierenden Bedingungen ermöglicht werden. Mit Hilfe von radioaktivem ATP wurde gezeigt, dass die Untereinheit C durch die Proteinkinase A phosphoryliert werden kann. Diesem Phänomen könnte eine große Bedeutung für die Regulation der Eigenschaften der Untereinheit C zukommen.

Die lichtgetriebene Protononenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) aus Halobacterium salinarum stellt den Prototyp lichtgetriebener Protonenpumpen dar und wurde durch strukturelle und spektroskopische Untersuchungen als einfaches Modellsystem für Protonentransferschritte in Proteinen etabliert. Aufgrund der schlechten heterologen Expression von BR in Wirtszellen konnten elektrophysiologische Untersuchungen unter kontrollierter Membranspannung jedoch nur vereinzelt durchgeführt werden und erlaubten kaum Rückschlüsse zum Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Pumpkraft des Proteins. Das dem BR nahverwandte Coccomyxa subellipsoidea Rhodopsin (CsR) hingegen zeigte gegenüber BR etwa 8-fach größere Photoströme in elektrophysiologischen Messungen in Xenopus laevis Oozyten und ermöglichte so eine umfangreiche elektrophysiologische Charakterisierung. Dabei konnten Unterschiede zu BR, wie etwa die erhöhte Spannungsabhängigkeit oder die erhöhte Toleranz der Pumpkraft gegenüber dem extrazellulären pH, auf Grundlage des Sequenzvergleiches nicht geklärt werden. Entsprechend wurden, um weitere mechanistische Details zu klären, im Rahmen dieser Arbeit spektroskopische und röntgenkristallographische Untersuchungen an CsR vorgenommen. Dabei konnte eine hochauflösende Kristallstruktur von CsR gelöst werden, die es erlaubt, mechanistische Unterschiede zu anderen lichtgetriebenen Protonenpumpen auf strukturelle Unterschiede zurück zu führen. So konnte die erhöhte Spannungsabhängigkeit mit der besonderen Komposition des zytoplasmatischen Halbkanals und die erhöhte Toleranz gegenüber dem äußeren pH mit der einzigartigen Konfiguration des Protonenfreisetzungskomplexes in CsR assoziiert werden. Letztlich konnte auf Grundlage der Struktur CsR, durch rationales Design, in einen licht-induzierten Protonenkanal transformiert werden, der bereits bei physiologischen Bedingungen quasisymmetrische bidirektionale Ströme zeigt. / The light-driven proton pump bacteriorhodopsin (BR) from Halobacterium salinarum represents the prototype of light-driven proton pumps and was established by structural and spectroscopic investigations as a simple model system for proton transfer steps in proteins. However, due to the poor heterologous expression of BR in host cells, electrophysiological investigations under controlled membrane potential could only be carried out in some cases and hardly allowed conclusions to be drawn about the influence of individual amino acids on the pumping force of the protein. Coccomyxa subellipsoidea rhodopsin (CsR), which is closely related to BR, showed about 8 times larger photocurrents in electrophysiological measurements in Xenopus laevis oocytes than BR and thus enabled an extensive electrophysiological characterization. Observed differences to BR, such as the increased voltage dependence or the increased tolerance of the pumping force to the extracellular pH, could not be clarified solely on the basis of the sequence comparison. Accordingly, in order to clarify further mechanistic details, spectroscopic and X-ray crystallographic investigations on CsR were carried out within the scope of this work. A high-resolution crystal structure of CsR was solved, which allows to link mechanistic differences to other light-driven proton pumps to structural differences. Thus, the increased voltage dependence could be addressed by the special composition of the cytoplasmic half channel and the increased tolerance to the external pH could be associated with the unique configuration of the proton release complex in CsR. Finally, by a structure-based rational design approach, CsR was transformed into a light-induced, which shows almost symmetrical bidirectional currents already under physiological conditions.

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