Die lichtgetriebene Protononenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) aus Halobacterium salinarum stellt den Prototyp lichtgetriebener Protonenpumpen dar und wurde durch strukturelle und spektroskopische Untersuchungen als einfaches Modellsystem für Protonentransferschritte in Proteinen etabliert. Aufgrund der schlechten heterologen Expression von BR in Wirtszellen konnten elektrophysiologische Untersuchungen unter kontrollierter Membranspannung jedoch nur vereinzelt durchgeführt werden und erlaubten kaum Rückschlüsse zum Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Pumpkraft des Proteins. Das dem BR nahverwandte Coccomyxa subellipsoidea Rhodopsin (CsR) hingegen zeigte gegenüber BR etwa 8-fach größere Photoströme in elektrophysiologischen Messungen in Xenopus laevis Oozyten und ermöglichte so eine umfangreiche elektrophysiologische Charakterisierung. Dabei konnten Unterschiede zu BR, wie etwa die erhöhte Spannungsabhängigkeit oder die erhöhte Toleranz der Pumpkraft gegenüber dem extrazellulären pH, auf Grundlage des Sequenzvergleiches nicht geklärt werden. Entsprechend wurden, um weitere mechanistische Details zu klären, im Rahmen dieser Arbeit spektroskopische und röntgenkristallographische Untersuchungen an CsR vorgenommen. Dabei konnte eine hochauflösende Kristallstruktur von CsR gelöst werden, die es erlaubt, mechanistische Unterschiede zu anderen lichtgetriebenen Protonenpumpen auf strukturelle Unterschiede zurück zu führen. So konnte die erhöhte Spannungsabhängigkeit mit der besonderen Komposition des zytoplasmatischen Halbkanals und die erhöhte Toleranz gegenüber dem äußeren pH mit der einzigartigen Konfiguration des Protonenfreisetzungskomplexes in CsR assoziiert werden. Letztlich konnte auf Grundlage der Struktur CsR, durch rationales Design, in einen licht-induzierten Protonenkanal transformiert werden, der bereits bei physiologischen Bedingungen quasisymmetrische bidirektionale Ströme zeigt. / The light-driven proton pump bacteriorhodopsin (BR) from Halobacterium salinarum represents the prototype of light-driven proton pumps and was established by structural and spectroscopic investigations as a simple model system for proton transfer steps in proteins. However, due to the poor heterologous expression of BR in host cells, electrophysiological investigations under controlled membrane potential could only be carried out in some cases and hardly allowed conclusions to be drawn about the influence of individual amino acids on the pumping force of the protein. Coccomyxa subellipsoidea rhodopsin (CsR), which is closely related to BR, showed about 8 times larger photocurrents in electrophysiological measurements in Xenopus laevis oocytes than BR and thus enabled an extensive electrophysiological characterization. Observed differences to BR, such as the increased voltage dependence or the increased tolerance of the pumping force to the extracellular pH, could not be clarified solely on the basis of the sequence comparison. Accordingly, in order to clarify further mechanistic details, spectroscopic and X-ray crystallographic investigations on CsR were carried out within the scope of this work. A high-resolution crystal structure of CsR was solved, which allows to link mechanistic differences to other light-driven proton pumps to structural differences. Thus, the increased voltage dependence could be addressed by the special composition of the cytoplasmic half channel and the increased tolerance to the external pH could be associated with the unique configuration of the proton release complex in CsR. Finally, by a structure-based rational design approach, CsR was transformed into a light-induced, which shows almost symmetrical bidirectional currents already under physiological conditions.

ABC (ATP-binding-cassette)-Transporter katalysieren den ATP-abhängigen Transport diverser niedermolekularer Substanzen durch die biologische Zellmembran. Ihr Vorkommen erstreckt sich auf alle drei Domänen des Lebens. Der Maltose Transporter von E.coli gehört zu dieser Superfamilie der ABC-Transporter. Die Kristallstrukturen des Transporters MalFGK2 wurden kürzlich gelöst für dessen inaktiven Zustand als auch für dessen katalytischen Zwischenzustand. Um den Transportmechanismus besser verstehen zu können, müssen die Kristallstrukturen des Transporters und seiner Komponenten unter physiologischen Bedingungen genau geprüft werden, um den daraus katalytischen Mechanismus zu bewerten. Im rahmen der Dissertation konnte mittels Lösungs-NMR kann gezeigt werden, dass die periplasmatische Schleife P2 von MalF eine unabhängige Faltung aufweist und eine wohl definierte Tertiärstruktur einnimmt, die vergleichbar ist mit der im Kristall vorliegenden Konformation. MalF-P2 interagiert unabhängig von der Transmembranregion von MalF und MalG mit dem Maltose-Bindeprotein in An- und Abwesenheit des Substrats mit einem KD im mikromolaren Bereich. NMR Untersuchungen zu den an der Interaktion beteiligten Aminosäuren stehen in Einklang mit den Kristallstrukturdaten. Die Analyse residualer dipolarer Kopplungen (RDC) zeigt, dass die Konformation der zwei individuellen Domänen von MalF-P2 in Abwesenheit von MalE erhalten bleibt und der im Kristall ähnelt. Die Zugabe von MalE induziert eine Änderung der relativen Orientierung der zwei Domänen von MalF-P2 um so dem räumlichen Anspruch des Liganden gerecht zu werden. Besonders betroffen hiervon ist die Domäne 2 von MalF-P2, deren Konformation abweicht von der in der Kristallstruktur. Die Struktur der Domäne 1 dagegen bleibt konserviert, während sich lediglich ihre relative Orientierung zu Domäne 2 ändert. MD Simulationen des MalF-P2-MalE-Komplexes deuten auf eine stark dynamische Interaktion von MalF-P2 mit der MalE Bindungsregion hin. NMR CPMG Kinetikstudien weisen auf die Bildung eines ungewöhnlichen Knicks in alhpa-Helix alpha2 während der Assoziation hin. Diese konformelle Änderung der alpha-Helix findet auf einer Zeitskala von Millisekunden statt, was im Einklang mit der Austauschrate der Komplexbildung ist. / ABC (ATP-binding-cassette)-transporters catalyze the ATP-dependent transport of diverse solutes across the cellular membrane. They are present in all three kingdoms of life. The E.coli maltose transporter belongs to the ATP binding cassette (ABC) transporter superfamily. Recently, the crystal structures of the full transporter MalFGK2 in its resting and a catalytic intermediate state was solved. At the present state of research, it is of particular interest to scrutinize the X-ray structures of the transporter and its components under physiological conditions as well as to evaluate their implications for the catalytic mechanism. In the context of the PhD thesis, it could be shown using solution-state NMR that the periplasmic loop P2 of MalF folds independently in solution and adopts a well-defined tertiary structure, which is similar to the one found in the crystal structure. MalF-P2 interacts with the maltose binding protein, independent of the transmembrane region of MalF and MalG, with a KD in the µM range, in the presence and absence of substrate. NMR studies showed good agreement of the residues interacting in solution to those identified in the X-ray structure. Analysis of residual dipolar coupling (RDC) experiments shows that the conformation of the two individual domains of MalF-P2 is preserved in the absence of MalE, and resembles the conformation in the X-ray structure. Upon titration of MalE to MalF-P2, the two domains of MalF-P2 change their relative orientation in order to accommodate the ligand. In particular, a conformational change of domain 2 of MalF-P2 is induced, which is distinct to the conformation found in the X-ray structure. Domain 1 retains its structure but changes its relative orientation to domain 2. MD simulations of the MalF-P2 – MalE complex show a highly dynamic interaction of MalF-P2 to the MalE interface. From NMR CPMG kinetic studies, a peculiar kink of alpha-helix alpha2 can be seen introduced upon association. The transition time of this conformational change of the alpha-helix is on the ms timescale, which is matching the exchange rate of the complex formation.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Proteine, die von Mikroorganismen exprimiert werden um Licht wahrzunehmen oder dessen Energie zu nutzen. Ionen-transportierende mikrobielle Rhodopsine begründeten das Feld der Optogenetik. Hier erlauben sie transmembrane Ionenflüsse lichtsensitiv zu machen und neuronale Aktivität mit Licht zu steuern. Eine zielführende Nutzung beruht auf ihrer molekularen Charakterisierung, um sie dem Experiment anzupassen und es sinnvoll zu entwerfen. Teil I der Arbeit beschäftigt sich mit dem rotverschobenen Kanalrhodopsin ReaChR. Obwohl es mit breitem, nicht gaussförmigen Aktionsspektrum mit maximalen Strömen um 600 nm publiziert wurde, zeigte das Blitzlichtspektrum hier maximale Aktivität bei 535 nm ohne Besonderheiten. Mit steigender Intensität und längeren Pulsen verbreiterte sich das Spektrum; sehr ähnlich zum publizierten Spektrum. Dieses einzigartige Verhalten wird durch sekundäre Photochemie erklärt, welche zu einem komplexen Photozyklus mit lichtinduzierten Übergangen führt. Mutationen an Schlüsselpositionen wurden genutzt, um ReaChR über die publizierten Daten hinaus zu charakterisieren und neue Eigenschaften zu generieren. In Teil II wurde die auswärtsgerichtete Natriumpumpe KR2 elektrophysiologisch charakterisiert, was zuvor von schlechter Membranständigkeit in Säugetierzellen verhindert wurde. Ein verbessertes KR2 mit höherer Membranständigkeit und 60-fach größeren Photoströmen erlaubte Selektivitätsmessungen, welche zeigten, dass der Strom von Natriumionen getragen wird, wohingegen nichts auf Protonentransport hindeutete. Bei ausreichender Substratkonzentration war der Strom anders als bei Chlorid- oder Protonenpumpen von der Membranspannung unabhängig. Die Expression in Mausneuronen ermöglichte die reversible Unterdrückung von Aktionspotentialen mit Licht, wobei der Ausstrom von Kationen einen komplementären Weg zur neuronale Aktivitätsunterdrückung bietet, wenn etablierte Werkzeuge schlecht oder nicht funktionieren. / Microbial rhodopsins are photosensitive proteins utilized by fungi, algae, and prokaryotes to sense light or harness its' energy. Ion transporting microbial rhodopsins initiated the field of optogenetics, where they are applied to render transmembrane ion fluxes light sensitive and control neuronal activity with light. Part I of the thesis focused on the electrophysiological characterization of the red-shifted channelrhodopsin ReaChR. Although published with a broad, non-Gaussian shaped action spectrum peaking around 600 nm, the flash action spectra of ReaChR recorded here had a maximum at 535 nm without peculiarities. Increasing intensities and prolonging illumination broadened the spectrum, which finally peaked around 600 nm. This unique behavior stems from pronounced secondary photochemistry leading to a complex photocycle with various light-induced transitions especially under constant illumination. Mutations at key positions like the central gate, DC-pair or counter ions were employed to characterize the properties of ReaChR beyond published data and engineer new features. In part II an electrophysiological characterization of the outward Na+ pump KR2 was pursued, which was hindered by poor membrane targeting in mammalian cells before. Engineering of eKR2 improved membrane targeting and lead to 60-fold larger photocurrents than in the wild type. Selectivity measurements revealed that the stationary photocurrent is primarily carried by sodium with no evidence for proton transport. At sufficient substrate concentration stationary photocurrents were independent of the membrane voltage distinguishing eKR2 from proton and chloride pumps. Finally, eKR2 reliably and reversibly inhibited action potential firing already at 0.5 mW/mm2 green illumination in cultured hippocampal mouse neurons. Inhibiting action potential firing through cation extrusion poses a complementary way of neuronal silencing in contexts where established tools are unfavorable or even impossible to use.

In den Firmicutes wird der Induktorausschluss (Katabolitrepression) durch das am Serin46 phosphorylierte HPr (PTS) vermittelt. Der genaue Mechanismus war jedoch unklar. Um diese Frage auf der Grundlage von isolierten Proteinen zu klären, wurde ein zum Escherichia coli Maltose-/Maltodextrin-ABC-Transporter homologes System aus Lactobacillus casei BL23 (MalE1-MalF1G1K12) als Modellsystem genutzt. Im Rahmen der Promotion wurde über isothermale Titrationskalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie gezeigt, dass das Bindeprotein MalE1 lineare und zyklische Maltodextrine, aber keine Maltose bindet. Experimentell ermittelte dreidimensionale Strukturen von MalE1 im Komplex mit diesen Zuckern belegten eine vergleichbar geschlossene Konformation und dienten zusätzlich als Grundlage, um die fehlende Maltosebindung zu erklären. Die Stimulierung der ATPaseaktivität des in Liposomen und Nanodiscs eingebauten Komplexes wurde jedoch hauptsächlich durch eine MalE1-Beladung mit linearen Maltodextrinen bewirkt. Eine bis zu 85 %ige Inhibierung der ATPaseaktivität durch P-Ser46-HPr belegte erstmals in vitro eine Interaktion von mehr als einem phosphorylierten Protein mit dem Transporter. Analog zum EIIAGlc-Inhibitor des homologen Systems aus E. coli wurden über Quervernetzungsexperimente und massenspektrometrische Analysen Interaktionen mit dem MalK1-Dimer als interagierende Komplexeinheit in der Nähe des Walker A-Motivs nachgewiesen. Über Fluoreszenzmessungen in Anwesenheit des ATP-Analogons TNP-ATP wurde eine unbeeinflusste ATP-Bindung und damit eine fehlende Blockade der γ-Phosphatbindestelle des Walker-A Motivs durch die Phosphorylgruppe von P-Ser46-HPr bestimmt. Die folgende Substitution verschiedener positiv geladener MalK1-Reste, die als potenzielle Interaktionsstellen für die Phosphorylgruppe fungieren könnten, identifizierte K63 in der Nähe des Walker A-Motivs als ersten möglichen Partner. Der genaue Mechanismus der Inhibierung bleibt jedoch unklar. / Catabolite repression is a global mechanism which controls the utilization of carbohydrates in bacteria. In Firmicutes HPr, a component of the phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system, prevents the uptake of less preferred sugars but only when it is phosphorylated at serine46. However the exact mechanism was unclear. To address this question the purified ATP-binding cassette transporter from Lactobacillus casei BL23 (MalE1-MalF1G1K12) was used as a model system, which is homologous to the Escherichia coli maltose/maltodextrin ABC importer. Isothermal titration calorimetry and fluorescence spectroscopy revealed that the binding protein MalE1 binds linear and cyclic maltodextrins but not maltose. Experimentally determined three-dimensional structures from MalE1 in complex with these sugars show a comparably closed conformation and served as a basis to explain the lack of maltose binding. The stimulation of the ATPase activity of the transporter incorporated in liposomes and nanodiscs however, was mainly caused by MalE1 loaded with linear maltodextrins. For the first time an inhibition of ATPase activity by P-Ser46-HPr up to 85 % and an interaction of more than one phosphorylated protein with the transporter was demonstrated. Analogous to the EIIAGlc inhibitor of the homologous system from E. coli, cross-linking experiments and mass spectrometric analyzes revealed interactions with the MalK1 dimer near the Walker A motif. Fluorescence measurements in the presence of the ATP analogue TNP-ATP, however, revealed an unaffected ATP binding and thus a lack of blockade of the γ-phosphate binding site (Walker A motif) by the phosphoryl group from P-Ser46-HPr. The following substitution of several positively charged MalK1 residues that could act as potential sites of interaction for the phosphoryl group, identified K63 near the Walker A motif as the first potential partner. The exact mechanism of inhibition, however, remains unclear.

ECF (Energy-Coupling Factor)-Transporter sind prokaryotische Aufnahmesysteme für Mikronährstoffe, die eine spezielle Gruppe von Transportern mit ATP-Bindekassette (ABC) darstellen. Sie beinhalten zwei asymmetrische Membranproteine, von denen eins (S) für die spezifische Bindung und Translokation des Substrates und das andere (T) für die Kopplung mit den ATPasen (A1,A2) zuständig ist. Bei ECF-Transportern der Subklasse I bilden diese Komponenten eine Einheit, während bei Vertretern der Subklasse II ein AAT-Modul mit wechselnden S-Einheiten interagiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Transportmechanismus, der eine Drehung der kompletten S-Einheit in der Membran beinhaltet, anhand des Biotintransporters BioMNY erstmals experimentell validiert. Durch Rekonstitution in Lipid-Nanodiscs, chemische Quervernetzung, fluoreszenz- und ESR-spektroskopische Techniken sowie einen Bindungstest mit radioaktivem Biotin wurde gezeigt, dass (i) die ATP-Bindung an die ATPasen zu einer Aufrichtung der S-Einheit (BioY) führt, (ii) diese Bewegung die Substratbeladung ermöglicht und (iii) BioY dabei ununterbrochen mit der T-Einheit (BioN) interagiert. Dies stellt einen Gegensatz zu Systemen der Subklasse II dar, für die ein ATP-abhängiger Austausch von S-Einheiten im Transportzyklus gezeigt worden war. Darüber hinaus wurde ein Escherichia coli-Stamm konstruiert, der durch Blockierung seines hochaffinen Biotintransporters und des -synthesewegs auf Spuren von Biotin nicht wachsen kann. Dieser Stamm ermöglichte einen eindeutigen Nachweis der Transportaktivität einiger solitärer BioY-Proteine. Aufgrund der einheitlichen Topologie von S-Einheiten ist ein Kippen auch für solitäre BioY-Varianten wahrscheinlich. Auch die metallspezifischen S-Einheiten CbiM und NikM besitzen ohne AAT-Modul eine basale Co2+- bzw. Ni2+-Transportaktivität. Ein ESR-spektroskopischer Kobaltnachweises zeigte, dass die aus nur zwei Membranhelices bestehende CbiN-Einheit für die Metallbeladung von CbiM essentiell ist. / ECF (Energy-Coupling Factor) transporters are a subgroup of ABC transporters that mediate uptake of micronutrients into prokaryotic cells. In contrast to canonical ABC importers, ECF transporters comprise two unrelated membrane proteins, one of which is responsible for specific and high affinity substrate binding (S) and the other one constitutes the coupling component (T) between S and the cytosolic ABC-ATPases (A1,A2). Subclass I transporters consist of four dedicated components whereas in subclass II transporters, a central AAT-module may interact with various S units. The biotin specific subclass I ECF transporter BioMNY was used to experimentally verify the hitherto hypothetic transport mechanism, which involves a rotation of the S unit within the membrane. With a series of experiments including reconstitution of BioMNY into lipid nanodiscs, site-specific cross-linking, a substrate binding assay with radioactive biotin and both fluorescence and EPR spectroscopic techniques, the ATP-dependent rotation of BioY (S) as a prerequisite for substrate binding and release was shown for the first time for an ECF transporter. Unlike subclass II transporters, for which an ATP-dependent release of the S unit was proposed, BioY interacts continuously with BioN (T) during the transport cycle. In a second focus of the work, an Escherichia coli reporter strain for biotin transporters was constructed. Due to inactivation of both biotin synthesis and the intrinsic high affinity biotin transporter, this strain was not capable of growing on trace amounts of biotin. With the use of this strain, transport activity of recombinantly produced solitary BioY proteins that naturally lack other ECF components was evidenced. Transport activity in the absence of AAT modules is also a feature of the Co2+ and Ni2+ specific S components CbiM and NikM. An EPR spectroscopic Co2+ detection assay helped underscoring the essential role of the small membrane protein CbiN for Co2+ loading of CbiM.