Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O HIV-1 possui uma importante diversidade genética. Essa diversidade decorre das limitações de fidelidade da transcriptase reversa durante a replicação, acentuada pela alta capacidade de geração e pelo rápido turnover viral. A transcrição reversa é um evento crucial do ciclo de vida viral e pode sofrer a influência de diversos fatores, como, por exemplo, o estado de ativação celular e a concentração de deoxrribonucleotídeos. A redução da variabilidade e tamanho das populações quasispecies, como as que acontecem durante a transmissão do HIV-1, coloca em risco a sua sobrevivência. A proposta deste estudo foi analisar a geração da diversidade genética após um ciclo único de replicação usando partículas virais pseudotipadas com envelopes R5 e X4 do HIV-1 em cultivo celular. Para tanto, PBMCs de indivíduos saudáveis foram estimuladas com fitohemaglutinina antes e durante infecção. Células em repouso também foram infectadas. Quarenta e oito clones provirais foram obtidos por End Point-PCR para cada condição. Em seguida, um fragmento de 1050pb do gene pol foi seqüenciado para todos os clones. As mutações acumuladas em um evento único de transcrição viral foram analisadas e comparadas com a seqüência do HIV-1 presente no inóculo original (tempo zero). Os resultados mostraram uma alta taxa de substituições em todas as condições de cultura e a existência de contextos comuns entre as seqüências onde ocorrem as substituições, destacando-se as regiões 200 a 350pb, 400 a 650pb, 750 a 800pb e 950 a 1025pb no grupo R5 e as regiões 375 a 525pb, 600 a 650pb e 775 a 975pb no grupo X4. Nestas regiões, o processo mutacional é intenso, os eventos que mais ocorrem são as transições e as substituições mais freqüentes são as de G para A e de T para C. A taxa mutacional encontrada foi de 2,0 x 10-3 /nt/ciclo no grupo R5 e 1,07 x 10-3 /nt/ciclo no grupo X4, valores muito acima dos comumente encontrados. A distribuição dos sítios onde ocorrem as mutações é influenciada pelo estágio de ativação em que as células alvo se encontram no momento da infecção, com regiões mais sujeitas a variação em segmentos de sequência quando as células estão ativadas. A maior diversidade encontrada no grupo R5 indica um papel importante desta variante viral no estabelecimento da infecção. Esse aumento brusco na diversidade genética viral pode fazer parte de uma estratégia do vírus em recuperar parte diversidade genética perdida na população durante os eventos de transmissão. / HIV-1 has an important genetic diversity that results from the rapid viral turnover rate and from reverse transcritase errors during viral DNA synthesis. Reverse transcription is a crucial step during HIV-1 replication cycle and its accuracy depends on balanced cellular dNTP pools. HIV-1 populations correspond to an organized swarm of mutants named quasispecies. If a quasispecies population goes throught transmission genetic bottlenecks and looses its best adapted variants, the fitness of the entire population is reduced. In the present work we studied the HIV-1 genetic diversity generated after a single replication cycle using CCR5 and CXCR4 pseudotyped particles in cell culture. Resting PBMCs from healthy donors were stimulated with PHA before and during HIV-1 infection. Resting PBMCs were also infected. 48 proviral DNA clones were obtained by End Point-PCR from each infected culture. A 1050pb fragment from pol was sequenced from all clones. All sequences were compared to the original sequence at time 0 and mutations introduced after a single replicartion cycle were tabulated. Observed mutations were not uniformly distributed occurring more frequently between the nucleotide 200 and 350, 400 and 650pb, 750 and 800pb and 950 and 1025pb in R5 pseudotypes and between the nucleotide 375 and 525pb, 600 and 650pb and 775 and 975pb in X4 pseudotypes. G to A and T to C transitions were the most frequent substituition type. The calculated mutational tax was 2,0 x 10-3 /nt/cycle for R5 virus and 1,07 x 10-3 /nt/cycle for X4. Both mutational taxes were higher than the ones currently described for HIV-1. The distribution of sites where mutations occur is influenced by the cellular activation status with mutations clustering in sequence segments in activated cells. R5 pseudotypes accumulated more variation than X4 virus, suggesting that R5 virus host colonization soon after transmission may be a part of a HIV-1 strategy to recuperate the genetic diversity reduction during the transmission bottleneck / FAPESP: 06/51495-6 / BV UNIFESP: Teses e dissertações