Queratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) são um grupo de enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise da queratina. A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. kr6 apresenta elevada produção de queratinases extracelulares, demonstrando potencial para bioconversão de substratos constituídos por queratina. O presente trabalho teve como principal objetivo purificar e imobilizar uma queratinase produzida pelo Chryseobacterium sp. kr6. As condições ótimas para a atividade proteolítica da queratinase foram estabelecidas com o auxílo das ferramentas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta. Os resultados demonstraram que tais condições foram atingidas ao utilizar pH na faixa de 7,4 a 9,2, 35°C a 50°C e concentração de NaCl de 50 a 340 mmol L-1. A especificidade da queratinase frente a diferentes substratos também foi investigada, indicando a preferência da enzima por resíduos hidrofóbicos ou positivamente carregados. A completa purificação da queratinase envolveu a precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de permeação em gel e troca aniônica. A amostra obtida após as referidas etapas apresentou um fator de purificação de 40,2 vezes e atividade específica de 21.466 U mg-1 de proteína. A massa molecular da enzima, determinada por SDS-PAGE, foi, de aproximadamente, 20 kDa. Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a inativação térmica da queratinase, sob diferentes condições, foram estimados. A partir dos resultados obtidos, observou-se que a presença de cálcio aumenta significativamente a estabilidade térmica da enzima. Comparando com as amostras controles, o tempo de meia vida da enzima purificada na presença de Ca2+ aumentou 7,3, 20,2 e 9,8 vezes, a 50°C, 55°C e 60ºC, respectivamente. A atividade enzimática foi significativamente inibida na presença de EDTA e 1,10-fenantrolina, sugerindo se tratar de uma metaloprotease. O desenvolvimento de um suporte a base de quitosana para a imobilização covalente da queratinase purificada foi investigado. Para isso, foram avaliados os efeitos de diferentes concentrações de glutaraldeído e tempo de contato deste com as esferas de quitosana, sobre o percentual de imobilização da enzima. Os melhores resultados obtidos para a imobilização da queratinase ao suporte foram ao utilizar concentração de glutaraldeído na faixa de 34 a 56 g L-1 e um período de ativação das esferas na faixa de 6 a 10 h. Sob tais condições, obteve-se 80% de imobilização da enzima. A partir das condições ótimas para a imobilização da enzima ao suporte, apontadas pela metodologia de superfície de resposta, estimou-se a capacidade de carga máxima do suporte, sendo esta de 58,8 U g-1. A enzima imobilizada apresentou maior estabilidade térmica quando comparada com a forma livre, além de reter 63,4% da atividade enzimática inicial após cinco reutilizações. / Keratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) are a group of proteolytic enzymes that are able to catalize the keratin hydrolysis. The keratinolytic Chryseobacterium sp. kr6 strain shows high extracellular keratinases production, suggesting potential for bioconversion of keratinous substrates. The present work had as main objective to purify and immobilize a keratinase from Chryseobacterium sp. kr6. The optimal conditions for proteolytic activity were established with aid of experimental design and response surface methodology. The results demonstrated that the best conditions were at pH range of 7.4 to 9.2, 35°C to 50°C and NaCl concentration from 50 to 340 mmol L-1. Keratinase specificity for various substrates also was investigated, suggesting that the enzyme had preference for hydrophobic and positively charged residues. The keratinase purification involved precipitation with ammonium sulphate and chromatographic techniques of gel permeation and anionic exchange. The final sample obtained after the purification steps presents a purification factor of 40.2-fold and specific activity of 21,466 U mg-1 of protein. The molecular weight of the enzyme, determined by SDS-PAGE, was around 20 kDa. The kinetics and thermodynamics parameters for thermal keratinase inactivation, under different conditions, were estimated. From results, it was possible to observe that the calcium affect significantly the thermal stability of the enzyme. Comparing with the control samples, the half-life time of the purified enzyme with calcium increased about 7.3, 20.2 and 9.8-fold, at 50°C, 55°C and 60°C, respectively. The enzyme activity was significantly inhibited in the presence of EDTA and 1,10- phenanthroline, suggesting that the enzyme belongs to metalloprotease group. The developing of a chitosan support for covalent immobilization of the purified keratinase was investigated. The effects of different glutaraldehyde concentrations, as well as, the activation time required for the chitosan beads on the enzyme immobilization were investigated. The optimal conditions for enzyme immobilization were at glutaraldehyde concentration ranging from 34 to 56 g L-1 and activation time of 6 to 10 h. Under these conditions, above 80% of added enzyme was covalently immobilized on the support. From the best conditions, indicated by response surface methodology, the load capacity of the macrospheres was estimated, being of 58.8 U g-1. The immobilized enzyme presented higher thermal stability when compared with free one, besides it retained 63,4% of the initial enzyme activity after five cicles of reuse.

Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. / Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.

Queratinases são proteases de especial interesse devido a sua ação sobre a queratina insolúvel, que por sua vez, é o principal componente das penas. As penas de aves são fonte de aminoácidos, e, portanto, são transformadas em farinha de pena e utilizadas em ração animal. Entretanto, este produto possui baixo valor nutricional devido a sua baixa digestibilidade, já que a queratina não é degradada por enzimas proteolíticas comuns. Nesse contexto, as queratinases microbianas são uma abordagem promissora para conversão de queratina em hidrolisados proteicos. Os objetivos deste trabalho foram selecionar e identificar bactérias termófilas provenientes do bioma Caatinga (Brasil) capazes de produzir queratinases termoativas, e caracterizar a queratinase produzida pelo isolado selecionado. Oito bactérias proteolíticas foram isoladas de uma amostra de solo. Destas, o Anoxybacillus sp. PC2 produziu queratinase com maior atividade em meio composto por penas (2%), KH2PO4 (0,04%), K2HPO4 (0,2%) e NaCl (0.05%) em pH 6,5 e 60 ºC. A protease queratinolítica foi parcialmente purificada por concentração em dispositivo de filtração (10.000 NMWL) e cromatografia de troca aniônica. A protease parcialmente purificada foi ativa em uma faixa de pH de 5 a 10, com alta atividade entre as temperaturas de 50 e 80 ºC. A atividade ótima foi observada em pH 7 e entre 50 e 60 ºC, tornando-a adequada para utilização em processos biotecnológicos para bioconversão de queratina. Um estudo molecular conduzido para identificar a provável protease queratinolítica produzida pelo Anoxybacillus sp. PC2 identificou uma metaloprotease neutra, cujo gene apresentou 98% de similaridade com o gene nprS de Geobacillus stearothermophilus. / Keratinases are proteases of special interest due to their action on insoluble keratin, which in turn, is the major component of feathers. The poultry feathers are a source of amino acids, and therefore, are converted to feather meal to be used as animal feedstuff. However, this product has low nutritional value due to its poor digestibility, since keratin is not degraded by common proteolytic enzymes. In this context, microbial keratinases are a promising approach to convert keratin into protein hydrolysates. The aims of this study were to select and identify thermophilic bacteria from Caatinga biome (Brazil) capable to produce thermoactive keratinases, and characterize the keratinase produced by the selected isolate. Eight proteolytic bacteria were isolated from a soil sample. Of these, Anoxybacillus sp. PC2 produced keratinase with higher activity in a medium composed of 2% feather waste, 0.04% KH2PO4, 0.2% K2HPO4 and 0.05% NaCl at pH 6.5 incubated at 60 ºC. The keratinolytic protease was partially purified by concentration in a centrifugal filter device (10,000 NMWL) and anion-exchange chromatography. The partially purified protease was active in a pH range of 5.0-10.0 with high activity in temperature range of 50-80 ºC. The optimum activity was observed at pH 7.0 and 50-60 ºC, making it suitable for biotechnological processes for keratin bioconversion. A molecular study conducted to identify the presumable keratinolytic protease produced by Anoxybacillus sp. PC2 identified a neutral metalloprotease whose gene showed 98% similarity with Geobacillus stearothermophilus nprS gene.

Queratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) são um grupo de enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise da queratina. A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. kr6 apresenta elevada produção de queratinases extracelulares, demonstrando potencial para bioconversão de substratos constituídos por queratina. O presente trabalho teve como principal objetivo purificar e imobilizar uma queratinase produzida pelo Chryseobacterium sp. kr6. As condições ótimas para a atividade proteolítica da queratinase foram estabelecidas com o auxílo das ferramentas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta. Os resultados demonstraram que tais condições foram atingidas ao utilizar pH na faixa de 7,4 a 9,2, 35°C a 50°C e concentração de NaCl de 50 a 340 mmol L-1. A especificidade da queratinase frente a diferentes substratos também foi investigada, indicando a preferência da enzima por resíduos hidrofóbicos ou positivamente carregados. A completa purificação da queratinase envolveu a precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de permeação em gel e troca aniônica. A amostra obtida após as referidas etapas apresentou um fator de purificação de 40,2 vezes e atividade específica de 21.466 U mg-1 de proteína. A massa molecular da enzima, determinada por SDS-PAGE, foi, de aproximadamente, 20 kDa. Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a inativação térmica da queratinase, sob diferentes condições, foram estimados. A partir dos resultados obtidos, observou-se que a presença de cálcio aumenta significativamente a estabilidade térmica da enzima. Comparando com as amostras controles, o tempo de meia vida da enzima purificada na presença de Ca2+ aumentou 7,3, 20,2 e 9,8 vezes, a 50°C, 55°C e 60ºC, respectivamente. A atividade enzimática foi significativamente inibida na presença de EDTA e 1,10-fenantrolina, sugerindo se tratar de uma metaloprotease. O desenvolvimento de um suporte a base de quitosana para a imobilização covalente da queratinase purificada foi investigado. Para isso, foram avaliados os efeitos de diferentes concentrações de glutaraldeído e tempo de contato deste com as esferas de quitosana, sobre o percentual de imobilização da enzima. Os melhores resultados obtidos para a imobilização da queratinase ao suporte foram ao utilizar concentração de glutaraldeído na faixa de 34 a 56 g L-1 e um período de ativação das esferas na faixa de 6 a 10 h. Sob tais condições, obteve-se 80% de imobilização da enzima. A partir das condições ótimas para a imobilização da enzima ao suporte, apontadas pela metodologia de superfície de resposta, estimou-se a capacidade de carga máxima do suporte, sendo esta de 58,8 U g-1. A enzima imobilizada apresentou maior estabilidade térmica quando comparada com a forma livre, além de reter 63,4% da atividade enzimática inicial após cinco reutilizações. / Keratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) are a group of proteolytic enzymes that are able to catalize the keratin hydrolysis. The keratinolytic Chryseobacterium sp. kr6 strain shows high extracellular keratinases production, suggesting potential for bioconversion of keratinous substrates. The present work had as main objective to purify and immobilize a keratinase from Chryseobacterium sp. kr6. The optimal conditions for proteolytic activity were established with aid of experimental design and response surface methodology. The results demonstrated that the best conditions were at pH range of 7.4 to 9.2, 35°C to 50°C and NaCl concentration from 50 to 340 mmol L-1. Keratinase specificity for various substrates also was investigated, suggesting that the enzyme had preference for hydrophobic and positively charged residues. The keratinase purification involved precipitation with ammonium sulphate and chromatographic techniques of gel permeation and anionic exchange. The final sample obtained after the purification steps presents a purification factor of 40.2-fold and specific activity of 21,466 U mg-1 of protein. The molecular weight of the enzyme, determined by SDS-PAGE, was around 20 kDa. The kinetics and thermodynamics parameters for thermal keratinase inactivation, under different conditions, were estimated. From results, it was possible to observe that the calcium affect significantly the thermal stability of the enzyme. Comparing with the control samples, the half-life time of the purified enzyme with calcium increased about 7.3, 20.2 and 9.8-fold, at 50°C, 55°C and 60°C, respectively. The enzyme activity was significantly inhibited in the presence of EDTA and 1,10- phenanthroline, suggesting that the enzyme belongs to metalloprotease group. The developing of a chitosan support for covalent immobilization of the purified keratinase was investigated. The effects of different glutaraldehyde concentrations, as well as, the activation time required for the chitosan beads on the enzyme immobilization were investigated. The optimal conditions for enzyme immobilization were at glutaraldehyde concentration ranging from 34 to 56 g L-1 and activation time of 6 to 10 h. Under these conditions, above 80% of added enzyme was covalently immobilized on the support. From the best conditions, indicated by response surface methodology, the load capacity of the macrospheres was estimated, being of 58.8 U g-1. The immobilized enzyme presented higher thermal stability when compared with free one, besides it retained 63,4% of the initial enzyme activity after five cicles of reuse.

Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. / Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.

Queratinases são proteases de especial interesse devido a sua ação sobre a queratina insolúvel, que por sua vez, é o principal componente das penas. As penas de aves são fonte de aminoácidos, e, portanto, são transformadas em farinha de pena e utilizadas em ração animal. Entretanto, este produto possui baixo valor nutricional devido a sua baixa digestibilidade, já que a queratina não é degradada por enzimas proteolíticas comuns. Nesse contexto, as queratinases microbianas são uma abordagem promissora para conversão de queratina em hidrolisados proteicos. Os objetivos deste trabalho foram selecionar e identificar bactérias termófilas provenientes do bioma Caatinga (Brasil) capazes de produzir queratinases termoativas, e caracterizar a queratinase produzida pelo isolado selecionado. Oito bactérias proteolíticas foram isoladas de uma amostra de solo. Destas, o Anoxybacillus sp. PC2 produziu queratinase com maior atividade em meio composto por penas (2%), KH2PO4 (0,04%), K2HPO4 (0,2%) e NaCl (0.05%) em pH 6,5 e 60 ºC. A protease queratinolítica foi parcialmente purificada por concentração em dispositivo de filtração (10.000 NMWL) e cromatografia de troca aniônica. A protease parcialmente purificada foi ativa em uma faixa de pH de 5 a 10, com alta atividade entre as temperaturas de 50 e 80 ºC. A atividade ótima foi observada em pH 7 e entre 50 e 60 ºC, tornando-a adequada para utilização em processos biotecnológicos para bioconversão de queratina. Um estudo molecular conduzido para identificar a provável protease queratinolítica produzida pelo Anoxybacillus sp. PC2 identificou uma metaloprotease neutra, cujo gene apresentou 98% de similaridade com o gene nprS de Geobacillus stearothermophilus. / Keratinases are proteases of special interest due to their action on insoluble keratin, which in turn, is the major component of feathers. The poultry feathers are a source of amino acids, and therefore, are converted to feather meal to be used as animal feedstuff. However, this product has low nutritional value due to its poor digestibility, since keratin is not degraded by common proteolytic enzymes. In this context, microbial keratinases are a promising approach to convert keratin into protein hydrolysates. The aims of this study were to select and identify thermophilic bacteria from Caatinga biome (Brazil) capable to produce thermoactive keratinases, and characterize the keratinase produced by the selected isolate. Eight proteolytic bacteria were isolated from a soil sample. Of these, Anoxybacillus sp. PC2 produced keratinase with higher activity in a medium composed of 2% feather waste, 0.04% KH2PO4, 0.2% K2HPO4 and 0.05% NaCl at pH 6.5 incubated at 60 ºC. The keratinolytic protease was partially purified by concentration in a centrifugal filter device (10,000 NMWL) and anion-exchange chromatography. The partially purified protease was active in a pH range of 5.0-10.0 with high activity in temperature range of 50-80 ºC. The optimum activity was observed at pH 7.0 and 50-60 ºC, making it suitable for biotechnological processes for keratin bioconversion. A molecular study conducted to identify the presumable keratinolytic protease produced by Anoxybacillus sp. PC2 identified a neutral metalloprotease whose gene showed 98% similarity with Geobacillus stearothermophilus nprS gene.

Queratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) são um grupo de enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise da queratina. A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. kr6 apresenta elevada produção de queratinases extracelulares, demonstrando potencial para bioconversão de substratos constituídos por queratina. O presente trabalho teve como principal objetivo purificar e imobilizar uma queratinase produzida pelo Chryseobacterium sp. kr6. As condições ótimas para a atividade proteolítica da queratinase foram estabelecidas com o auxílo das ferramentas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta. Os resultados demonstraram que tais condições foram atingidas ao utilizar pH na faixa de 7,4 a 9,2, 35°C a 50°C e concentração de NaCl de 50 a 340 mmol L-1. A especificidade da queratinase frente a diferentes substratos também foi investigada, indicando a preferência da enzima por resíduos hidrofóbicos ou positivamente carregados. A completa purificação da queratinase envolveu a precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de permeação em gel e troca aniônica. A amostra obtida após as referidas etapas apresentou um fator de purificação de 40,2 vezes e atividade específica de 21.466 U mg-1 de proteína. A massa molecular da enzima, determinada por SDS-PAGE, foi, de aproximadamente, 20 kDa. Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a inativação térmica da queratinase, sob diferentes condições, foram estimados. A partir dos resultados obtidos, observou-se que a presença de cálcio aumenta significativamente a estabilidade térmica da enzima. Comparando com as amostras controles, o tempo de meia vida da enzima purificada na presença de Ca2+ aumentou 7,3, 20,2 e 9,8 vezes, a 50°C, 55°C e 60ºC, respectivamente. A atividade enzimática foi significativamente inibida na presença de EDTA e 1,10-fenantrolina, sugerindo se tratar de uma metaloprotease. O desenvolvimento de um suporte a base de quitosana para a imobilização covalente da queratinase purificada foi investigado. Para isso, foram avaliados os efeitos de diferentes concentrações de glutaraldeído e tempo de contato deste com as esferas de quitosana, sobre o percentual de imobilização da enzima. Os melhores resultados obtidos para a imobilização da queratinase ao suporte foram ao utilizar concentração de glutaraldeído na faixa de 34 a 56 g L-1 e um período de ativação das esferas na faixa de 6 a 10 h. Sob tais condições, obteve-se 80% de imobilização da enzima. A partir das condições ótimas para a imobilização da enzima ao suporte, apontadas pela metodologia de superfície de resposta, estimou-se a capacidade de carga máxima do suporte, sendo esta de 58,8 U g-1. A enzima imobilizada apresentou maior estabilidade térmica quando comparada com a forma livre, além de reter 63,4% da atividade enzimática inicial após cinco reutilizações. / Keratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) are a group of proteolytic enzymes that are able to catalize the keratin hydrolysis. The keratinolytic Chryseobacterium sp. kr6 strain shows high extracellular keratinases production, suggesting potential for bioconversion of keratinous substrates. The present work had as main objective to purify and immobilize a keratinase from Chryseobacterium sp. kr6. The optimal conditions for proteolytic activity were established with aid of experimental design and response surface methodology. The results demonstrated that the best conditions were at pH range of 7.4 to 9.2, 35°C to 50°C and NaCl concentration from 50 to 340 mmol L-1. Keratinase specificity for various substrates also was investigated, suggesting that the enzyme had preference for hydrophobic and positively charged residues. The keratinase purification involved precipitation with ammonium sulphate and chromatographic techniques of gel permeation and anionic exchange. The final sample obtained after the purification steps presents a purification factor of 40.2-fold and specific activity of 21,466 U mg-1 of protein. The molecular weight of the enzyme, determined by SDS-PAGE, was around 20 kDa. The kinetics and thermodynamics parameters for thermal keratinase inactivation, under different conditions, were estimated. From results, it was possible to observe that the calcium affect significantly the thermal stability of the enzyme. Comparing with the control samples, the half-life time of the purified enzyme with calcium increased about 7.3, 20.2 and 9.8-fold, at 50°C, 55°C and 60°C, respectively. The enzyme activity was significantly inhibited in the presence of EDTA and 1,10- phenanthroline, suggesting that the enzyme belongs to metalloprotease group. The developing of a chitosan support for covalent immobilization of the purified keratinase was investigated. The effects of different glutaraldehyde concentrations, as well as, the activation time required for the chitosan beads on the enzyme immobilization were investigated. The optimal conditions for enzyme immobilization were at glutaraldehyde concentration ranging from 34 to 56 g L-1 and activation time of 6 to 10 h. Under these conditions, above 80% of added enzyme was covalently immobilized on the support. From the best conditions, indicated by response surface methodology, the load capacity of the macrospheres was estimated, being of 58.8 U g-1. The immobilized enzyme presented higher thermal stability when compared with free one, besides it retained 63,4% of the initial enzyme activity after five cicles of reuse.

Queratinases são proteases de especial interesse devido a sua ação sobre a queratina insolúvel, que por sua vez, é o principal componente das penas. As penas de aves são fonte de aminoácidos, e, portanto, são transformadas em farinha de pena e utilizadas em ração animal. Entretanto, este produto possui baixo valor nutricional devido a sua baixa digestibilidade, já que a queratina não é degradada por enzimas proteolíticas comuns. Nesse contexto, as queratinases microbianas são uma abordagem promissora para conversão de queratina em hidrolisados proteicos. Os objetivos deste trabalho foram selecionar e identificar bactérias termófilas provenientes do bioma Caatinga (Brasil) capazes de produzir queratinases termoativas, e caracterizar a queratinase produzida pelo isolado selecionado. Oito bactérias proteolíticas foram isoladas de uma amostra de solo. Destas, o Anoxybacillus sp. PC2 produziu queratinase com maior atividade em meio composto por penas (2%), KH2PO4 (0,04%), K2HPO4 (0,2%) e NaCl (0.05%) em pH 6,5 e 60 ºC. A protease queratinolítica foi parcialmente purificada por concentração em dispositivo de filtração (10.000 NMWL) e cromatografia de troca aniônica. A protease parcialmente purificada foi ativa em uma faixa de pH de 5 a 10, com alta atividade entre as temperaturas de 50 e 80 ºC. A atividade ótima foi observada em pH 7 e entre 50 e 60 ºC, tornando-a adequada para utilização em processos biotecnológicos para bioconversão de queratina. Um estudo molecular conduzido para identificar a provável protease queratinolítica produzida pelo Anoxybacillus sp. PC2 identificou uma metaloprotease neutra, cujo gene apresentou 98% de similaridade com o gene nprS de Geobacillus stearothermophilus. / Keratinases are proteases of special interest due to their action on insoluble keratin, which in turn, is the major component of feathers. The poultry feathers are a source of amino acids, and therefore, are converted to feather meal to be used as animal feedstuff. However, this product has low nutritional value due to its poor digestibility, since keratin is not degraded by common proteolytic enzymes. In this context, microbial keratinases are a promising approach to convert keratin into protein hydrolysates. The aims of this study were to select and identify thermophilic bacteria from Caatinga biome (Brazil) capable to produce thermoactive keratinases, and characterize the keratinase produced by the selected isolate. Eight proteolytic bacteria were isolated from a soil sample. Of these, Anoxybacillus sp. PC2 produced keratinase with higher activity in a medium composed of 2% feather waste, 0.04% KH2PO4, 0.2% K2HPO4 and 0.05% NaCl at pH 6.5 incubated at 60 ºC. The keratinolytic protease was partially purified by concentration in a centrifugal filter device (10,000 NMWL) and anion-exchange chromatography. The partially purified protease was active in a pH range of 5.0-10.0 with high activity in temperature range of 50-80 ºC. The optimum activity was observed at pH 7.0 and 50-60 ºC, making it suitable for biotechnological processes for keratin bioconversion. A molecular study conducted to identify the presumable keratinolytic protease produced by Anoxybacillus sp. PC2 identified a neutral metalloprotease whose gene showed 98% similarity with Geobacillus stearothermophilus nprS gene.

Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. / Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.