Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

Na Península Antártica, uma grande concentração de aves nidifica anualmente; ainda assim, não é observado o acúmulo de penas no ambiente, sugerindo a ação da microbiota local. As queratinases são o grupo de enzimas capazes de degradar a queratina, identificadas majoritariamente em micro- organismos meso e termofílicos. O objetivo deste trabalho foi a identificação de bactérias queratinolíticas psicrofílicas ou psicrotolerantes, como uma nova alternativa para o uso de queratinases em processos industriais. Amostras de penas foram coletadas em pinguineiras na ilha Rei George, Antártida, o material semeado em meio ágar farinha de penas (AFP, 10 g L-1) e incubado entre 4 e 30 ºC. Seis isolados bacterianos capazes de crescer em AFP foram selecionados e inoculados em meio ágar leite, sendo que três deles formaram halos de proteólise entre 9 e 30 °C, preferencialmente em pH 9,0. Seu DNA foi extraído e o gene do rRNA 16S amplificado e sequenciado. Os isolados proteolíticos foram identificados como Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) e Chryseobacterium sp. (A17U). O sobrenadante de cultivo das três bactérias foi caracterizado ao longo de 7 dias de incubação em meio caldo farinha de penas (CFP, 10 g L-1), entre 20 °C e 40 °C sendo que todas apresentaram crescimento e produção enzimática ótimos a 20 °C, entre o 3° e o 4° dia. De acordo com os zimogramas, a linhagem A08 foi produtora de uma única protease, A17U de três e A03 de nove enzimas. Esta última se destacou por ser capaz de degradar o substrato farinha de penas quase completamente em 7 dias de cultivo e por tolerar concentrações relativamente altas de NaCl sendo, por isso, selecionada para a análise filogenética, na qual isolado foi identificado como Lysobacter concretionis, com um valor de bootstrap de 100%, e para a purificação por cromatografia de filtração em gel, Sistema Aquoso Bifásico (SAB) e Partição em Três Fases (TPP). O melhor resultado foi obtido na TPP, com a recuperação de 82% da atividade enzimática e um fator de purificação de 3,59 vezes, sendo possível a detecção de cinco bandas, de aproximadamente 70, 65, 50, 40 e 30 kDa no gel SDS-PAGE. Este é o primeiro trabalho que reporta uma grande capacidade queratinolítica pela linhagem psicrotolerante Lysobacter concretionis A03, sendo o seu emprego biotecnológico e industrial compatível com a redução de gastos energéticos para a degradação de resíduos queratinosos. / In the Antarctic Peninsula, high concentrations of birds nest every year; nevertheless, their feathers do not accumulate in the environment, suggesting the action of the local microbiota. Keratinases are the enzymes able to degrade keratin, identified mainly in thermophilic and mesophilic micro-organisms. The aim of this work was the identification of psychrophilic or psychrotolerant feather degrading bacteria, in order to reduce the energy consumption for the industrial application of keratinases. Penguin feathers samples were collected in King George Island, Antarctic, the material was spread in feather meal agar plates (FMA 1%) and incubated at 4 – 30 °C. Six isolates capable of growing on FMA were selected and incubated in skimmed milk agar; of these, three formed clear zones indicative of proteolytic activity, between 9 and 30°C, preferable at pH 9.0. Total DNA of isolates was extracted and the rRNA 16S gene was amplified and sequenced. Proteolytic isolates were identified as Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) and Chryseobacterium sp. (A17U). The crude extract of the three bacteria was characterized along 7 days of cultivation at 20 to 40°C on feather meal broth (FMB, 1%). All bacterial strains showed medium alkalinization, optimum growing and enzymatic production at 20 °C, between third and fourth days, in despite of its optimal enzymatic activity on azocasein and azokeratin have been determined between 35 and 40°C. According to zymography, strain A08 produced only one protease, A17U three and A03 nine proteolytic enzymes, this later standing out due to their high feather meal degradation in 7 days of cultivation and by their tolerance to high salt concentrations, being, therefore, selected for Phylogenetic analysis, purification methods of gel filtration chromatography, aqueous two-phase partition (ATP) and three-phase partition (TPP). The isolate was identified by phylogeny as Lysobacter concretionis, with a bootstrap value of 100%. The best results in purification were achieved by TPP, despite has not been possible the isolation of a single protein, with recovery of 82% of enzymatic activity and a purification factor of 3.59. The SDS-PAGE showed the presence of five bands of approximately 70, 65, 50, 40 and 30 kDa. This is the first report of great keratinolytic ability by the psychrotolerant strain of Lysobacter concretionis A03, thus, its industrial use its compatible with the reduction of energetic costs for the degradation of keratin wastes by enzymatic digestion.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-25Bitstream added on 2014-06-13T21:03:26Z : No. of bitstreams: 1 santos_e_dr_arafcf.pdf: 7245371 bytes, checksum: cb0c4511a4ad674226e788f40dc0c01a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Enzimas são catalisadores fundamentais para os sistemas biológicos sendo amplamente estudadas e aplicadas em todo o mundo, especialmente na área da saúde. Neste trabalho foi avaliada a aplicação de enzimas quitinolíticas e queratinolíticas em ensaios in vitro contra Pedicullus humanus capitis e na degradação de calos humanos, respectivamente. Foram selecionados os micro-organismos com maior potencial para produção dessas enzimas e determinados os parâmetros de produção, as condições de separação, purificação e caracterização das enzimas. Os micro-organismos com maior potencial para a produção de quitinases e queratinases foram os fungos Metarhizium anisopliae CG374 e Aspergillus oryzae, respectivamente. As maiores produções de quitinases foram obtidas em biorreator a 28°C, pH 7,0, 1,5 vvm e 200 rpm após 120 h. Quando produzida em biorreator hiperbárico sob pressão de 5 bar, apresentou um aumento de 21,3% na produtividade em relação ao biorreator convencional. Para queratinases em biorreator, os parâmetros de produção foram 28°C, pH 6, 200 rpm, 1,5 vvm e 120 h. A produção das quitinases e queratinases em biorreator foi 83 e 154% maior do que em frascos Erlenmeyer, respectivamente. A quitinase foi concentrada 5,12 vezes na purificação apresentando massas molares aproximadas de 24, 28 e 80 kDa. Fração purificada contendo quitinase apresentou estabilidade a 40°C por 60 minutos. A queratinase foi concentrada 4,52 vezes após purificação com massas molares de 40 e 50 kDa apresentando estabilidade térmica a 40°C por 60 min. A avaliação das enzimas quitinolíticas frente a piolhos humanos apontou para uma eficiência 9,1% maior quando comparadas com produtos comerciais. A avaliação da ação de enzimas queratinolíticas na degradação de calos humanos demonstrou resultados significativos quando comparados com produtos disponíveis no mercado... / Enzymes are catalysts for fundamental biological systems is extensively studied and applied worldwide, especially in health. In this study were evaluated the application of enzymes chitinolytic and keratinolytic in tests in vitro against Pedicullus humanus capitis and degradation of human callus, respectively. Were selected microorganisms with the greatest potential for production of these enzymes and determined the production parameters, conditions of separation, purification and characterization of enzymes. The microorganisms with the higher potential for the production of chitinases and keratinases were Metarhizium anisopliae CG374 and Aspergillus oryzae, respectively. The highest yields of chitinases obtained in fermentations in a bioreactor were 28°C, pH 7.0, 1.5 vvm and 200 rpm after 120 h. When produced in the hyperbaric bioreactor at a pressure of 5 bar, an increase of 21.3% in yield over conventional production in a conventional bioreactor was observed. To keratinases in a bioreactor, the production parameters were 28°C, pH 6.0, 200 rpm, and 1.5 vvm after 120h. The production of chitinases and keratinases in bioreactor was 83 and 154% higher than in Erlenmeyer flasks, respectively. The chitinase was 5.12 times concentred on the purification presenting molar weight of approximately 24, 28 and 78 kDa. Fraction containing purified chitinase showed thermal stability of 40°C for 60 min. Keratinase was concentred 4.52 times after purification and presents molar weight of 40 and 50 kDa. The purified fraction was thermal stability at 40°C for 60 min. Evaluation of chitinolytic enzymes against human lice showed an efficiency of 9.1% higher for the enzymatic extract when compared with commercial products. The evaluation of the action of keratinolytic enzyme in the degradation of human callus showed significative results when compared to products on the market less time reaching maximum degradation

Na Península Antártica, uma grande concentração de aves nidifica anualmente; ainda assim, não é observado o acúmulo de penas no ambiente, sugerindo a ação da microbiota local. As queratinases são o grupo de enzimas capazes de degradar a queratina, identificadas majoritariamente em micro- organismos meso e termofílicos. O objetivo deste trabalho foi a identificação de bactérias queratinolíticas psicrofílicas ou psicrotolerantes, como uma nova alternativa para o uso de queratinases em processos industriais. Amostras de penas foram coletadas em pinguineiras na ilha Rei George, Antártida, o material semeado em meio ágar farinha de penas (AFP, 10 g L-1) e incubado entre 4 e 30 ºC. Seis isolados bacterianos capazes de crescer em AFP foram selecionados e inoculados em meio ágar leite, sendo que três deles formaram halos de proteólise entre 9 e 30 °C, preferencialmente em pH 9,0. Seu DNA foi extraído e o gene do rRNA 16S amplificado e sequenciado. Os isolados proteolíticos foram identificados como Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) e Chryseobacterium sp. (A17U). O sobrenadante de cultivo das três bactérias foi caracterizado ao longo de 7 dias de incubação em meio caldo farinha de penas (CFP, 10 g L-1), entre 20 °C e 40 °C sendo que todas apresentaram crescimento e produção enzimática ótimos a 20 °C, entre o 3° e o 4° dia. De acordo com os zimogramas, a linhagem A08 foi produtora de uma única protease, A17U de três e A03 de nove enzimas. Esta última se destacou por ser capaz de degradar o substrato farinha de penas quase completamente em 7 dias de cultivo e por tolerar concentrações relativamente altas de NaCl sendo, por isso, selecionada para a análise filogenética, na qual isolado foi identificado como Lysobacter concretionis, com um valor de bootstrap de 100%, e para a purificação por cromatografia de filtração em gel, Sistema Aquoso Bifásico (SAB) e Partição em Três Fases (TPP). O melhor resultado foi obtido na TPP, com a recuperação de 82% da atividade enzimática e um fator de purificação de 3,59 vezes, sendo possível a detecção de cinco bandas, de aproximadamente 70, 65, 50, 40 e 30 kDa no gel SDS-PAGE. Este é o primeiro trabalho que reporta uma grande capacidade queratinolítica pela linhagem psicrotolerante Lysobacter concretionis A03, sendo o seu emprego biotecnológico e industrial compatível com a redução de gastos energéticos para a degradação de resíduos queratinosos. / In the Antarctic Peninsula, high concentrations of birds nest every year; nevertheless, their feathers do not accumulate in the environment, suggesting the action of the local microbiota. Keratinases are the enzymes able to degrade keratin, identified mainly in thermophilic and mesophilic micro-organisms. The aim of this work was the identification of psychrophilic or psychrotolerant feather degrading bacteria, in order to reduce the energy consumption for the industrial application of keratinases. Penguin feathers samples were collected in King George Island, Antarctic, the material was spread in feather meal agar plates (FMA 1%) and incubated at 4 – 30 °C. Six isolates capable of growing on FMA were selected and incubated in skimmed milk agar; of these, three formed clear zones indicative of proteolytic activity, between 9 and 30°C, preferable at pH 9.0. Total DNA of isolates was extracted and the rRNA 16S gene was amplified and sequenced. Proteolytic isolates were identified as Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) and Chryseobacterium sp. (A17U). The crude extract of the three bacteria was characterized along 7 days of cultivation at 20 to 40°C on feather meal broth (FMB, 1%). All bacterial strains showed medium alkalinization, optimum growing and enzymatic production at 20 °C, between third and fourth days, in despite of its optimal enzymatic activity on azocasein and azokeratin have been determined between 35 and 40°C. According to zymography, strain A08 produced only one protease, A17U three and A03 nine proteolytic enzymes, this later standing out due to their high feather meal degradation in 7 days of cultivation and by their tolerance to high salt concentrations, being, therefore, selected for Phylogenetic analysis, purification methods of gel filtration chromatography, aqueous two-phase partition (ATP) and three-phase partition (TPP). The isolate was identified by phylogeny as Lysobacter concretionis, with a bootstrap value of 100%. The best results in purification were achieved by TPP, despite has not been possible the isolation of a single protein, with recovery of 82% of enzymatic activity and a purification factor of 3.59. The SDS-PAGE showed the presence of five bands of approximately 70, 65, 50, 40 and 30 kDa. This is the first report of great keratinolytic ability by the psychrotolerant strain of Lysobacter concretionis A03, thus, its industrial use its compatible with the reduction of energetic costs for the degradation of keratin wastes by enzymatic digestion.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

Na Península Antártica, uma grande concentração de aves nidifica anualmente; ainda assim, não é observado o acúmulo de penas no ambiente, sugerindo a ação da microbiota local. As queratinases são o grupo de enzimas capazes de degradar a queratina, identificadas majoritariamente em micro- organismos meso e termofílicos. O objetivo deste trabalho foi a identificação de bactérias queratinolíticas psicrofílicas ou psicrotolerantes, como uma nova alternativa para o uso de queratinases em processos industriais. Amostras de penas foram coletadas em pinguineiras na ilha Rei George, Antártida, o material semeado em meio ágar farinha de penas (AFP, 10 g L-1) e incubado entre 4 e 30 ºC. Seis isolados bacterianos capazes de crescer em AFP foram selecionados e inoculados em meio ágar leite, sendo que três deles formaram halos de proteólise entre 9 e 30 °C, preferencialmente em pH 9,0. Seu DNA foi extraído e o gene do rRNA 16S amplificado e sequenciado. Os isolados proteolíticos foram identificados como Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) e Chryseobacterium sp. (A17U). O sobrenadante de cultivo das três bactérias foi caracterizado ao longo de 7 dias de incubação em meio caldo farinha de penas (CFP, 10 g L-1), entre 20 °C e 40 °C sendo que todas apresentaram crescimento e produção enzimática ótimos a 20 °C, entre o 3° e o 4° dia. De acordo com os zimogramas, a linhagem A08 foi produtora de uma única protease, A17U de três e A03 de nove enzimas. Esta última se destacou por ser capaz de degradar o substrato farinha de penas quase completamente em 7 dias de cultivo e por tolerar concentrações relativamente altas de NaCl sendo, por isso, selecionada para a análise filogenética, na qual isolado foi identificado como Lysobacter concretionis, com um valor de bootstrap de 100%, e para a purificação por cromatografia de filtração em gel, Sistema Aquoso Bifásico (SAB) e Partição em Três Fases (TPP). O melhor resultado foi obtido na TPP, com a recuperação de 82% da atividade enzimática e um fator de purificação de 3,59 vezes, sendo possível a detecção de cinco bandas, de aproximadamente 70, 65, 50, 40 e 30 kDa no gel SDS-PAGE. Este é o primeiro trabalho que reporta uma grande capacidade queratinolítica pela linhagem psicrotolerante Lysobacter concretionis A03, sendo o seu emprego biotecnológico e industrial compatível com a redução de gastos energéticos para a degradação de resíduos queratinosos. / In the Antarctic Peninsula, high concentrations of birds nest every year; nevertheless, their feathers do not accumulate in the environment, suggesting the action of the local microbiota. Keratinases are the enzymes able to degrade keratin, identified mainly in thermophilic and mesophilic micro-organisms. The aim of this work was the identification of psychrophilic or psychrotolerant feather degrading bacteria, in order to reduce the energy consumption for the industrial application of keratinases. Penguin feathers samples were collected in King George Island, Antarctic, the material was spread in feather meal agar plates (FMA 1%) and incubated at 4 – 30 °C. Six isolates capable of growing on FMA were selected and incubated in skimmed milk agar; of these, three formed clear zones indicative of proteolytic activity, between 9 and 30°C, preferable at pH 9.0. Total DNA of isolates was extracted and the rRNA 16S gene was amplified and sequenced. Proteolytic isolates were identified as Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) and Chryseobacterium sp. (A17U). The crude extract of the three bacteria was characterized along 7 days of cultivation at 20 to 40°C on feather meal broth (FMB, 1%). All bacterial strains showed medium alkalinization, optimum growing and enzymatic production at 20 °C, between third and fourth days, in despite of its optimal enzymatic activity on azocasein and azokeratin have been determined between 35 and 40°C. According to zymography, strain A08 produced only one protease, A17U three and A03 nine proteolytic enzymes, this later standing out due to their high feather meal degradation in 7 days of cultivation and by their tolerance to high salt concentrations, being, therefore, selected for Phylogenetic analysis, purification methods of gel filtration chromatography, aqueous two-phase partition (ATP) and three-phase partition (TPP). The isolate was identified by phylogeny as Lysobacter concretionis, with a bootstrap value of 100%. The best results in purification were achieved by TPP, despite has not been possible the isolation of a single protein, with recovery of 82% of enzymatic activity and a purification factor of 3.59. The SDS-PAGE showed the presence of five bands of approximately 70, 65, 50, 40 and 30 kDa. This is the first report of great keratinolytic ability by the psychrotolerant strain of Lysobacter concretionis A03, thus, its industrial use its compatible with the reduction of energetic costs for the degradation of keratin wastes by enzymatic digestion.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-25Bitstream added on 2014-06-13T18:31:30Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_gm_me_rcla.pdf: 243960 bytes, checksum: a79bd4d2995d8e646a1a343bffbaba1d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Neste trabalho estudou-se a queratinase produzida por uma cepa de Streptomyces sp LMI-1 isolada de uma fábrica de processamento de aves domésticas. A enzima degradou 87% das penas após 120h de cultivo. Ela foi estimulada por íons Ba+2 e inibida por Ca+2, Mn+2, EDTA e Hg+. O pH ótimo de atividade da enzima foi 8,5 e a temperatura de maior atividade foi 60oC. A enzima é estável por até 2h em 50oC. Na análise do caldo de cultura detectou-se a presença dos aminoácidos serina, metionina, prolina, tirosina e leucina logo após 72h de cultivo. A enzima apresenta potencial para utilização industrial na produção de ração animal. / In the present work was studied keratinase produced by Streptomyces sp LMI-1 isolated of an industrial plant of poultry processing when cultived with feathers as a carbon source. The enzyme degraded 87% of feathers after 120 hours. The enzyme was stimulated by Ba+2 and inhibited by Ca+2, Mn+2, EDTA and Hg+. The optimum pH and temperature for the enzyme was 8,5 and 60oC, respectively. The enzyme was stable after 2 hours at 50oC. The culture broth analysis by thin layer chromatogram showed presence of amino acids serine, methionine, proline, tyrosine and leucine after 72 hours of incubation. The enzyme presents potential for industrial use in the production of animal feed preparation.