La résistance aux antibiotiques par les micro-organismes est une menace mondiale. C'est pourquoi la recherche de nouveaux médicaments revêt une importance capitale de nos jours.Le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) est un cofacteur essentiel et un substrat dans de nombreuses réactions biologiques. Pour cette raison, les enzymes qui l'utilisent comme substrat et celles qui participent à sa biosynthèse sont largement étudiées en tant que cibles antibactériennes potentielles. Dans ce contexte, nous nous intéressons au développement de nouveaux agents antibactériens contre la quinolinate synthase (NadA). Cette enzyme participe à la voie de biosynthèse de novo du NAD chez les procaryotes et est essentielle chez deux pathogènes : Helicobacter pylori, responsable d'ulcères et de cancers gastriques, et Mycobacterium leprae, responsable de la lèpre. Le fait que NadA n'existe que chez les procaryotes et qu'elle est essentielle chez deux agents pathogènes font de NadA une cible intéressante pour la conception de nouveaux antibactériens. La quinolinate synthase est une enzyme [4Fe-4S] où l'un des atomes de Fe est coordonné par une molécule d'eau à l'état de repos et joue le rôle d'acide de Lewis durant la catalyse. La réaction catalysée par NadA consiste en la formation d'acide quinolinique (QA), précurseur du NAD, à partir d'iminoaspartate et de dihydroxyacétone phosphate. Sur la base de la découverte dans notre laboratoire du premier inhibiteur de NadA (le DTHPA), qui agit par coordination irréversible du fer catalytique du cluster, nous avons conçu et synthétisé une famille de molécules pouvant servir d'inhibiteurs plus spécifiques de NadA. Ces molécules contiennent un cycle benzène / pyridine ou pyrazine, deux carboxylates vicinaux et un thiol en tant que groupe coordinant du fer: l’acide 4-mercaptophtalique (4MP), l’acide 6-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylique (6MPDC), l’acide 5-mercaptopyrazine-2, 3-dicarboxylique (5MPzDC) et l’acide 5-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylique (5MPDC). Nous avons démontré que ces molécules inhibent l’enzyme NadA in vitro avec un IC50 du même ordre de grandeur que celui du DTHPA (dizaine de µM). Par l’utilisation de diverses spectroscopies et de la cristallographie, nous avons démontré que l'inhibition s’effectue par la coordination de ces molécules avec le fer catalytique du cluster via leur groupement thiol. Nous avons également étudié in vitro la spécificité de ces molécules. Nous avons montré que les molécules 4MP et 5MPDC étaient des inhibiteurs spécifiques de NadA lorsqu’on les teste sur l’aconitase B, une enzyme [4Fe-4S] bactérienne, dont le cluster présente des propriétés structurales et fonctionnelles similaires à celles du cluster de NadA.Enfin, nous avons étudié l'activité d'inhibitrice de l’ensemble des molécules in cellulo sur de la voie de biosynthèse du QA chez Escherichia coli avec le DTHPA comme contrôle. Alors que les molécules 6MPDC et 5MPzDC inhibent la croissance d’E. coli de manière indépendante de la voie de biosynthèse du QA, le 4MP et le 5MPDC (les deux inhibiteurs spécifiques in vitro) n'ont montré aucune activité inhibitrice in cellulo. Ce manque d'activité pouvant être dû à un manque de pénétration des molécules à l'intérieur des bactéries, nous avons envisagé de favoriser la pénétration à l'aide d'un vecteur transmembranaire, un analogue simplifié du tétra-cyclopeptide naturel FR235222. Nous avons synthétisé et couplé le cyclopeptide à l'inhibiteur 4MP. Malheureusement, aucune inhibition de la croissance d'E. coli n'a été observée. La thèse s’est terminée en essayent de comprendre la pénétration du tétra-cyclopeptide sur bactérie, en utilisant notamment des agents fluorophores. / Resistance to antibiotics is becoming a world-wide threat. Microorganisms are able to withstand drugs leading to persistence of diseases. This is why the research of new drugs is of great importance nowadays.Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is an essential cofactor and substrate in numerous biological reactions. For this reason, both the enzymes that use it as a substrate and those participating on its biosynthetic pathway are largely studied as potential antibacterial targets. In this context, we are interested in the development of new antibacterial drugs against quinolinate synthase enzyme (NadA). This enzyme participates in the prokaryotic NAD de novo biosynthetic pathway and is essential in two pathogens: Helicobacter pylori, cause of gastric ulcers and cancers, and Mycobacterium leprae, responsible of leprosy. The fact that NadA only exists in prokaryotes and the fact that it is essential for these two pathogens make it an interesting target for the design of new antibacterial drugs. Quinolinate synthase is a [4Fe-4S] cluster enzyme, where one of the Fe sites is coordinated by a water molecule in the resting state, and plays a Lewis acid role during catalysis. The reaction catalyzed by NadA consists in the formation of quinolinic acid (QA), precursor of NAD, from iminoaspartate and dihydroxyacetone phosphate. Based on the discovery in our laboratory of the first inhibitor of NadA (DTHPA) that coordinates irreversibly the catalytic iron site of the cluster, we designed and synthesized a family of molecules as potential more specific NadA inhibitors. These molecules contain a benzene/pyridine or pyrazine ring, two vicinal carboxylates and a thiol as an iron coordinating group: 4-mercaptophthalic acid (4MP), 6-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylic acid (6MPDC), 5-mercaptopyrazine-2, 3-dicarboxylic acid (5MPzDC) and 5-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylic acid (5MPDC). We demonstrated that these molecules inhibit NadA enzyme in vitro in the same range as DTHPA. Using different spectroscopies and crystallography, we demonstrated that inhibition occurs by coordination of the molecules to the catalytic iron site through their thiol group. We investigated also in vitro the specificity of these molecules. We demonstrated that 4MP and 5MPDC molecules are specific NadA inhibitors when assayed on bacterial aconitase B, a [4Fe-4S] enzyme, whose cluster displays functional and structural properties similar to those of NadA.Finally, we investigated the QA pathway inhibition activity of the four molecules in cellulo, in an Escherichia coli strain. Whereas, 6MPDC and 5MPzDC molecules inhibit E. coli growth in a QA biosynthetic pathway independent manner, 4MP and 5MPDC (the two in vitro specific inhibitors) did not show any in cellulo inhibition activity. Since this lack of activity might be due to a lack of penetration of the molecules inside bacteria, we thought about assisting the penetration of the molecules using a transmembrane carrier, a simplified analogue of the tetra-cyclopeptide FR235222 natural product. We synthetized and coupled the cyclopeptide to the 4MP inhibitor. Unfortunately, no E. coli growth inhibition was observed. The Ph.D ended by investigating the penetration of the tetra-cyclopeptide inside bacteria, using some fluorophore agents.

Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est un cofacteur clé du métabolisme cellulaire. Synthétisé à partir d'acide quinolinique (QA) chez tous les organismes vivants, la biosynthèse du QA diffère entre les eucaryotes et les procaryotes. Chez les eucaryotes, il est produit à partir de L-tryptophane alors que chez les procaryotes et les plantes, il est synthétisé par l'action concertée de deux enzymes: la L-aspartate oxydase (NadB) qui permet la formation d'iminoaspartate (IA) à partir de L-aspartate et la quinolinate synthase (NadA) qui permet la condensation de deux molécules, la dihydroxyacétone-phosphate (DHAP) et l'iminoaspartate, pour former l'acide quinolinique. En plus de cette voie dite « de novo », la plupart des organismes possèdent une voie de secours qui produit le NAD à partir de niacine provenant de l'alimentation ou de la dégradation du NAD. Chez certains pathogènes tels que Mycobacterium leprae et Helicobacter pylori, cette voie de secours n'existe pas. Ceci fait de NadA une cible particulièrement attractive pour la conception d'antibactériens et ceci d'autant plus qu'elle est absente chez l'homme.NadA est la seule enzyme de la voie de biosynthèse de novo du NAD dont le mécanisme moléculaire et la structure tridimensionnelle sous forme active (avec son centre [4Fe-4S]2+) sont inconnus. Grâce à l'utilisation d'analogues de substrats ou d'intermédiaires réactionnels, nous avons pu non seulement avancer dans l'élucidation du mécanisme moléculaire de NadA et notamment dans la compréhension du rôle du centre [4Fe-4S]2+ dans la catalyse mais en plus, nous avons été en mesure de proposer un 1er inhibiteur in vitro et in vivo de NadA : l'acide 4,5 Dithiohydroxyphtalique (DTHPA). Le DTHPA nous a fourni de bonnes bases pour la conception d'inhibiteurs puissants et spécifiques de NadA grâce à une étude Structure-Activité. Par ailleurs, nous avons résolu la 1ère structure aux rayons X de NadA sous forme holoprotéine dont les données structurales nous ont grandement aidé dans la compréhension du mécanisme de NadA. / The Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) is a key cofactor essential for cellular metabolism. Synthesized from quinolinic acid (QA) in all living organisms, NAD biosynthesis is different between eucaryotes and procaryotes. Indeed, most of eukaryotes produce QA from L-tryptophan, whereas most of prokaryotes and plants synthesize QA by the concerted action of 2 enzymes: L-aspartate oxydase (NadB), an FAD enzyme, which catalyzes L-Aspartate oxidation to form iminoaspartate (IA) while quinolinate synthetase (NadA) allows condensation between IA and Dihydroxyacetone Phosphate (DHAP) to produce QA. Besides this « de novo » pathway, most eukaryotes and some bacteriae have a salvage pathway which allows NAD synthesis from nutrients and metabolites of NAD degradation in order to maintain a correct pool of NAD in the cell. However, some pathogens like Mycobacterium leprae, Helicobacter pylori do not possess this pathway. As a consequence, NadA represents a very attractive target for designing specific antibacterial agents since it does not exist in Human.NadA is the only metalloenzyme of NAD de novo biosynthesis whose molecular mechanism and tridimensional structure with its [4Fe-4S]2+ cluster are unknown. Using substrate and intermediate analogues, we have been able to understand better NadA mechanism, especially [4Fe-4S]2+ cluster role in catalysis. Moreover, we proposed the first in vitro and in vivo inhibitor of NadA : the 4,5 Dithiohydroxyphtalic Acid (DTHPA) which gave us basis to design powerful and specific NadA inhibitors thanks to a structure-activity relationship study. Besides, we resolved the first X-rays structure of NadA under its holoprotein form. Datas we extracted from it helped us greatly to understand NadA mechanism.

Porteur redox intervenant dans nombre de processus métaboliques, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) est central pour les cellules vivantes. Outre son importance dans le métabolisme oxydoréductif, des données récentes suggèrent fortement d’autres rôles importants pour le NAD dans la signalisation cellulaire. Un système inductible d’enrichissement en NAD en surproduisant la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) d’Escherichia coli chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l’implication du NAD dans les mécanismes spécifiques de défenses qui régissent les interactions plante-pathogène. Par ailleurs, une dérégulation de la synthèse de NAD sur l’étape enzymatique catalysée par la QPT endogène d’Arabidopsis thaliana souligne le rôle critique du NAD dans la balance C/N des plantes, en particulier en bouleversant l’assimilation de l’azote en conditions photorespiratoires. Ces travaux nous ouvrent à une nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation impliquant le NAD dans les grandes fonctions métaboliques des plantes. / Plant development and functions are underpinned by redox reactions which depend on cofactors such as pyridine nucleotides as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Beside its redox properties, NAD has recently been implicated in cellular signalling. An inducible system based on Escherichia coli quinolinate phosphoribosyltransferase (QPT) overproduction in transgenic Arabidopsis thaliana was set up as a convenient experimental technique to raise NAD content. This build-up highlights the involvement of NAD in plant-pathogen specific defense mechanisms. Furthermore, manipulating endogenous Arabidopsis thaliana QPT levels was used to deregulate NAD production. Such an approach points out the critical role of NAD in C/N interactions by shaking up nitrogen assimilation upon photorespiratory conditions. These results pave the way for a new understanding of signalling mechanisms involving NAD in plants major metabolic functions.

Porteur redox intervenant dans nombre de processus métaboliques, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) est central pour les cellules vivantes. Outre son importance dans le métabolisme oxydoréductif, des données récentes suggèrent fortement d'autres rôles importants pour le NAD dans la signalisation cellulaire. Un système inductible d'enrichissement en NAD en surproduisant la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) d'Escherichia coli chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l'implication du NAD dans les mécanismes spécifiques de défenses qui régissent les interactions plante-pathogène. Par ailleurs, une dérégulation de la synthèse de NAD sur l'étape enzymatique catalysée par la QPT endogène d'Arabidopsis thaliana souligne le rôle critique du NAD dans la balance C/N des plantes, en particulier en bouleversant l'assimilation de l'azote en conditions photorespiratoires. Ces travaux nous ouvrent à une nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation impliquant le NAD dans les grandes fonctions métaboliques des plantes.

Quinolinate phosphoribosyltransferase (QPRTase, EC 2.4.2.19) is an intriguing enzyme which appears to catalyse two distinct chemical reactions; transfer of a phosphoribosyl moiety from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate to the nitrogen of quinolinic acid and decarboxylation at the 2-position to give nicotinic acid mononucleotide. The chemical mechanism of QPRTase is not fully understood. In particular, enzymatic involvement in the decarboxylation step is yet to be conclusively proven. QPRTase is neurologically important as it degrades the potent neurotoxin, quinolinic acid, implicated in diseases such as Huntington’s disease and AIDS related dementia. Due to its neurological importance and unusual chemistry the mechanism of QPRTase is important. Described here is a mechanistic study on human brain QPRTase. Human brain QPRTase was successfully expressed in E. coli BL21 (DE3) from the pEHISTEV-QPRTase construct and the protein was efficiently purified by nickel affinity chromatography. The crystal structure was solved using multiwavelength methods to a resolution of 1.9 Å. Human brain QPRTase was found to adopt an energetically stable hexameric arrangement. The enzyme was also found to exist as a hexamer during gel filtration under physiological conditions. Kinetic studies allowed the measurement of the kinetic parameters for quinolinic acid. The data gave a Km of 13.4 ± 1.0 μM and a Vmax of 0.92 ± 0.01 μM min-1. There was no evidence for cooperative binding of quinolinic acid to the six subunits of the QPRTase hexamer. The enzyme showed maximum activity at approximately pH 6. The active site of human brain QPRTase is a deep pocket with a highly positive electrostatic surface composed of three arginine residues, two lysine residues and one histidine residue. Mutation of these residues resulted in either complete loss or significant reduction in enzymatic activity showing they are important for binding and/or catalysis. A possible mechanism involving QPRTase in the decarboxylation of quinolinic acid mononucleotide was proposed. A series of quinolinic acid analogues were synthesised and tested as inhibitors of QPRTase. The inhibition studies highlighted some key interactions in the active site.

La Quinolinate synthase (NadA) catalyse la condensation de l'iminoaspartate et de la dihydroxyacétone phosphate aboutissant à la formation d'acide quinolinique, un intermédiaire central dans la biosynthèse du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Cette étude a permis de montrer que toutes les quinolinate synthases possèdent un centre [4Fe-4S] essentiel à l'activité et que seulement 3 résidus cystéines coordinent le centre métallique, les cystéines Cys113, Cys200 et Cys297 chez E. coli. Les propriétés spectroscopiques et biochimiques du centre [4Fe-4S] nous ont conduit à proposer que le centre fer-soufre joue un rôle de type aconitase/déshydratase dans la catalyse enzymatique. Deux autres cystéines impliquées dans la formation d'un pont disulfure, sont également essentielles à l'activité quinolinate synthase (Cys291 et Cys294 chez E. coli) en jouant probablement un rôle régulateur. Nous rapportons également une nouvelle hypothèse de mécanisme pour la formation de l'acide quinolinique, incluant l'isomérisation du glycéraldéhyde 3-phosphate en DHAP. Enfin, nous proposons NadA comme une cible potentielle d'agents antibactériens. Sur les différentes molécules testées in vitro, l'acide phosphoglycolohydroxamique (PGH) s'est avérée actif sur la quinolinate synthase d'E. coli et de M. tuberculosis, en agissant comme un inhibiteur compétitif du DHAP.