Th.--Méd.--Montpellier, 1911-1912. / Montpellier, 1911-1912, n ° 17.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse--Méd.--Reims, 1973. N°: N° 13. / Bibliogr. ff. 52-60.

Chez les vertébrés, les neurones qui contactent le LCR (NcLCR) sont présents autour des cavités ventriculaires et tout le long du canal central (cc). Par la combinaison d'enregistrements électrophysiologiques sur tranche de tronc cérébral et d'analyses immunohistochimiques, nous avons réalisé la première caractérisation de cette population neuronale chez la souris adulte. Nous montrons que les NcLCR sont présents autour du cc au niveau du complexe vagal dorsal (CVD), une structure bulbaire impliquée dans la régulation des fonctions autonomes, où ils sont principalement GABAergiques, reçoivent des afférences synaptiques GABA/Glycinergiques et expriment le canal PKD2L1 ("polycystin kidney disease 2-like 1"), un membre de la famille des canaux TRP ("transient receptor potential"). Nous montrons que l'activité de PKD2L1 est modulée par les variations de pH et d'osmolarité et que son augmentation module l'excitabilité des NcLCR. Finalement, nous démontrons que les NcLCR existent dans un état de maturité intermédiaire caractérisé par propriétés fonctionnelles de neurones matures combinées à la conservation de l'expression de marqueurs d'immaturités.Les NcLCR étant stratégiquement positionné entre le LCR et le parenchyme, ils pourraient détecter des signaux circulant grâce à l'activation de PKD2L1 puis distribuer le message collecté à leurs partenaires. Un tel rôle, apparaît particulièrement intéressant au niveau du CVD, un site de régulation majeur des fonctions autonomes et pourrait être démontré par l'identification du réseau neuronal où les NcLCR sont intégrés. / In vertebrates, cerebrospinal fluid contacting neurons (CSF-cN) are present around the ventricular cavities and along the central canal (cc). In this study, by the combination of whole cell patch-clamp recordings on brainstem slice and immunohistochemistry analysis, we realize the first characterization of this neuronal population in adult mice. We show that CSF-cN are present around the cc in the dorsal vagal complex (DVC), a major hindbrain structure regulating autonomic functions. There, CSF-cN are mostly GABAergics, receive GABA- and glycinergic synaptic entries and express functional polycystin kidney disease 2-like 1 (PKD2L1) channels. These channels are a subtype of the transient receptor potential (TRP) channels superfamily and this study represent the first analysis of PKD2L1 properties in a native system. We show that PKD2L1 channel activity is modulated by variations in extracellular pH and osmolarity and in turn, an enhanced activity of only few PKD2L1 channels participates in the modulation of CSF-cN excitability. Finally, we demonstrate that CSFcN exhibit another interesting property since they exist in an intermediate stage of maturity by displaying many mature functional properties combined to the conservation of the expression of immature markers.Because CSF-cN are strategically positioned between CSF and parenchyma, they could detect circulating signals through PKD2L1 activation and convey the collected messages to cellular partners. Such a role might be particularly relevant at the level of the DVC a major regulatory site for autonomic functions and should be demonstrated by identifying and characterizing the neuronal network CSFcN are involved in.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire auto-immune du SNC qui affecte 90 000 personnes en France et génère un coût important pour la société. La forme la plus fréquente (85% des cas) est la SEP récurrente-rémittente (RRMS) caractérisée par des poussées démyélinisantes entrecoupées de périodes de rémission après un syndrome cliniquement isolé (CIS). La conversion en RRMS après un CIS, caractérisée par une nouvelle poussée ou de nouvelles lésions sur les IRM de suivi, survient après un délai variant de quelques mois à plus de 10 ans (20% des cas, « SEP bénigne »). Les traitements disponibles (immunomodulateurs et immunosuppresseurs) ont une efficacité indéniable pour la prévention des poussées et doivent être initiés dès le diagnostic pour une efficacité maximale, surtout chez les patients montrant une conversion rapide en SEP après un CIS. Leur intérêt est en revanche négligeable pour les formes bénignes. Ainsi, il existe un besoin d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces de la SEP pour une prise en charge optimale des patients. Le but de ma thèse est d’identifier des biomarqueurs pronostiques de SEP en utilisant différentes approches de protéomique quantitative,. Dans un premier temps, nous avons utilisé des échantillons cliniques de LCR de patients. Ces travaux m’ont permis d’identifier, en protéomique quantitative utilisant un marquage chimique des peptides (TMT), plusieurs candidats biomarqueurs de SEP. Ceux-ci incluent deux chitinase-3-like protéines, CHI3L1 et CHI3L2 dont le taux mesuré en ELISA, dans le LCR, augmente avec l’évolution de la maladie. Ces travaux ont également démontré que la concentration sanguine de CHI3L1 constituait un biomarqueur de la progression de la maladie. Dans un second temps, nous avons combiné l’analyse du LCR de différents patients SEP et contrôles en protéomique Label-Free avec un modèle préclinique analysant les modifications du sécrétome d’oligodendrocytes murins en culture primaire par approche SILAC. Les biomarqueurs potentiels, 87 protéines correspondant à 226 peptides cibles, ont été ensuite vérifiés en protéomique quantitative ciblée ou parallel reaction monitoring (PRM), à l’aide de peptides marqués servant de référence. Les 11 candidats les plus discriminants issus de cette étape ont ensuite été vérifiés en PRM sur une cohorte plus large d’échantillons de patients. Finalement, 7 candidats ont montré un profil significatif au cours de cette première validation. Ces candidats biomarqueurs permettent notamment de discriminer les différentes formes évolutives de la SEP et de distinguer cette pathologie d’autres maladies inflammatoires et neurologiques. De plus, ces derniers pourraient avoir un intérêt prognostique permettant d’identifier les patients qui vont développer une SEP après la découverte fortuite de lésions typiques de la maladie à l’IRM. Ce travail de thèse a donc caractérisé de nouveaux biomarqueurs de SEP devant être validés sur de larges cohortes multicentriques de patients et ouvre de nouvelles perspectives sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la SEP. / Discovery, confirmation and verification of candidate biomarkers for multiple sclerosis diagnosis and prognosis in cerebrospinal fluid.Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory disease of the central nervous system. Most often the disease initiates by a first demyelinating event called clinically isolated syndrome (CIS), followed by remission periods and relapses occurring at irregular intervals. Clinical symptoms and MRI are used for diagnosis, but clinicians lack tools to predict the rate of disease progression. This study aims at identifying biomarkers that predict the delay of conversion to MS after a CIS. We compared the cerebrospinal fluid (CSF) proteome from MS patients and symptomatic controls and the CSF from CIS patients with rapid conversion to MS (<1 year) and CIS patients with slow conversion to MS (>2 years). For the discovery step, human CSF samples (n=40) depleted of the 20 major plasma proteins were digested using a modified filter-assisted sample preparation (FASP) and analysed by high-resolution mass spectrometry using isobaric mass tag labelling or label-free quantification procedures. Proteins upregulated in CSF from MS patients included two proteins involved in tissue remodeling, namely chitinase-3-like protein-1 (CHI3L1) and chitinase-3-like protein-2 (CHI3L2). Their increased level in CSF of MS patients was confirmed by ELISA in a new cohort comprising CIS and MS patients (n=123) at different disease stages. Moreover, CHI3L1 levels in CSF and serum from CIS patients discriminated patients with rapid conversion to MS (< one year) from those with slower conversion.We also implemented a PRM method (peptide selection, dilution optimization of heavy isotope labeled non-purified peptides, reproducibility evaluation and method validation) to qualify a larger set of candidate biomarkers (226 peptides corresponding to 87 proteins) in a cohort different from the one used for the discovery step (n=60), including CSF from controls and MS patients at different disease stages. Finally, to further verify the 11 candidate biomarkers that passed this qualification step, we monitored 16 peptides in a new PRM assay, using shorter gradient and high-purity heavy isotope labeled peptides. This new PRM analysis was performed on a larger cohort (n=189) that included CSF of patients with other inflammatory and non-inflammatory neurological disorders in addition to control and MS patients. These analyses identified seven robust candidate biomarkers, which might help to discriminate patients suffering from MS or other neurological disorders.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Cette thèse s'intéresse aux déplacements vertébraux induits par des chirurgies de la scoliose de type Cotrel-Dubousset, durant lesquelles une manoeuvre de dérotation d'un implant rachidien est réalisée. La quantification de ces déplacements est complexe, les segments instrumentés étant composés de plusieurs unités indépendantes, les vertèbres, pouvant se déplacer dans les 3 plans anatomiques. Une méthode permettant le suivi per-opératoire des vertèbres instrumentées a été développée, qui intègre des mesures per-opératoires à des modèles 3D des vertèbres réalisés à l'aide d'une technique de reconstruction stéréoradiographique. Pour cela, les méthodes de localisation d'objets utilisées en robotique sont jumelées aux outils de reconstruction et de visualisation déjà développés au laboratoire informatique sur la scoliose 3D de l'hôpital Ste-Justine. Les mesures per-opératoires ont été réalisées à l'aide d'un numériseur 3D à champs magnétiques. Cinq à six points, situés sur des surfaces pré-définies de la partie postérieure des vertèbres, ont été numérisés. Un programme de recalage points-surfaces, basé sur un processus itératif ainsi que sur les connaissances a priori de la localisation de ces points, permet d'ajuster les données per-opératoires au modèle 3D pré-opératoire de chaque vertèbre. Un modèle 3D per-opératoire est ainsi obtenu. Le système développé a été validé d'abord en simulant la numérisation per-opératoire, puis en réalisant des mesures sur une colonne sèche. Les positions estimées des points numérisés et des repères anatomiques (servant à réaliser le modèle 3D) ont ensuite été comparées aux positions connues sur un modèle de référence. Les résultats de cette validation ont permis de recommander d'utiliser un modèle 3D reconstruit à partir de 6 repères anatomiques par vertèbre, de corriger ces repères par un logiciel lissant leurs positions et minimisant les incohérences géométriques des modèles 3D vertébraux, de représenter les surfaces par des grilles et d'utiliser l'algorithme de recalage ICP (Iterative Closest Point). Un choix optimal de localisation et de nombre de points numérisés a aussi pu être offert. La première hypothèse clinique à vérifier était que la manoeuvre de dérotation induit peu de dérotation axiale des vertèbres, mais plutôt une dérotation en bloc de segments de la colonne et la deuxième qu'il existe un patron des déplacements vertébraux (translations et rotations) associé à la chirurgie C-D. Les mesures per-opératoires pré/post-instrumentation réalisées sur vingt-deux patients ont permis de vérifier qu'il y avait correction de la scoliose dans le plan frontal, de la cyphose et de la lordose dans le plan sagittal; que la dérotation axiale et les rotations intervertébrales n'étaient pas significatives. Les différences de translations et de rotations entre les vertèbres apicales et limites ont démontré que les vertèbres instrumentées subissaient pourtant des mouvements individuels. La première hypothèse est donc vérifiée puisque le principal mouvement des courbes instrumentées est une translation auquel se superposent des déplacements vertébraux individuels moins importants. La deuxième hypothèse a aussi été vérifiée. En effet, dans les plans frontal et sagittal, un patron des déplacements vertébraux a pu être déduit pour les courbes thoraciques droites et thoraciques droites-lombaires gauches. Les rotations axiales n'ont semblé obéir à aucune tendance reliée au type de courbe.

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Les antidépresseurs ont un effet antiallodynique qui dépend de la stimulation des récepteurs β2-adrénergiques. Ceux-ci stimulent la production d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) régulé par les phosphodiestérases de type 4 (PDE4). Nous avons ici étudié l’effet d’inhibiteurs de PDE (iPDE) sur la douleur neuropathique, grâce à des approches de pharmacologie comportementale chez la souris complétées par de l’imagerie calcium et des approches moléculaires. Nos résultats montrent un effet antiallodynique des iPDE4 et des iPDE5. L’action des iPDE4 est liée à une diminution d’expression du TNFα dans le ganglion rachidien et au recrutement des récepteurs delta des opioïdes. Celle des iPDE5 nécessite à la fois les récepteurs mu et delta. Nous montrons aussi que l’action d’un iPDE4 dépend de la dose, l’activation de cellules gliales semblant corrélée à l’effet antiallodynique à faible dose, alors que celle des neurones à forte dose a un effet pronociceptif via les récepteurs TRPV1. / Antidepressants have an antiallodynic action that is dependent on β2-adrenoceptor stimulation. These receptors stimulate the cAMP production, which is regulated by type 4 phosphodiesterases (PDE4). Here, we studied that action of PDE inhibitors (iPDE) on neuropathic pain, using behavioral pharmacology approaches in mice, completed by calcium imaging and molecular approaches. Our results show the iPDE4s and iPDE5s have an antiallodynic action. The iPDE4s act through a decreased expression of TNFα in dorsal root ganglia and the recruitment of the delta opioid receptors. The action of iPDE5 requires both mu and delta opioid receptors. We also show that the action of an iPDE4 depends on the dose, the activation of glial cells at low dose being correlated with an antiallodynic action, while the recruitment of neurons at higher doses has a pronociceptive action via TRPV1 receptors.

A la suite d'un traumatisme nerveux les neurones périphériques ont la capacité de régénérer. La repousse est possible grâce à l'environnement permissif et les aptitudes intrinsèques des neurones périphériques à entamer un processus régénératif. Cette capacité intrinsèque se traduit par des remaniements cellulaires et moléculaires induits notamment par la modification de l'expression de nombreux gènes. Ma thèse a porté sur l'étude de l'un d'entre eux : CaMKIα (Calcium-Calmodulin-dependent kinase Iα), dont nous avons montré l'induction de l'expression dans les neurones de ganglions rachidiens dorsaux par une lésion du nerf sciatique. Cette kinase, jamais encore décrite dans le système nerveux périphérique adulte, est impliquée dans le développement neuronal au niveau central. Nous avons établi que l'expression de CaMKIα est spécifiquement induite à la suite de différents types de traumatismes mécaniques du nerf sciatique (sections, compressions chroniques ou aiguës) dans une population restreinte de neurones lésés, majoritairement myélinisés. La localisation subcellulaire de CaMKIα, à la fois dans le corps cellulaire des neurones et dans les fibres du nerf sciatique, évoque un transport axonal de la kinase vers le site de lésion. L'inhibition de la voie de signalisation de CaMKIα par traitement pharmacologique ou l'utilisation de siRNA dirigés contre CaMKIα induit in vitro une chute significative de la vitesse de pousse des neurites des neurones lésés. L'ensemble de ces résultats suggère que l'induction de CaMKIα contribue à la régénération axonale post-lésionnelle des neurones périphériques. / Peripheral neurons have the capacity to regenerate after injury. This regeneration is allowed by thefavorable environment generated by the cellular components of the system and intrinsic aptitudes ofthe peripheral neurons to enter this process. These intrinsic abilities are manifested as cellular changes and molecular alterations including transcriptional and post-transcriptional modifications. Prior to my work, our laboratory carried out transcriptomic analysis on dorsal root ganglia after nerve injury. This allowed us to highlight a set of genes induced in response to peripheral nerve lesion. My thesis focused on one of them: CaMKIα (Calcium-Calmodulin-dependent kinase Iα). This kinase, not previously described in the adult peripheral nervous system, has been shown to be involved in central nervous system neuronal development. We have shown that CaMKIα is specifically induced following different kinds of mechanical lesions of the sciatic nerve (sections and acute or chronic crush) in a restricted, predominantly myelinated, population of injured neurons. The subcellular location of CaMKIα, both in the soma and nerve fibers suggest an axonal transit of the kinase to the injury site. The inhibition of the CaMKIα signaling pathway by a pharmacological compound or RNA silencing in vitro induced a significantly decreased velocity of neurite growth in injured neurons. Taken together, these results suggest that the induction of CaMKIα contributes to the post injury axonal regeneration of peripheral neurons.

Les erreurs innées du métabolisme (EIM) constituent un large panel de désordres métaboliques héréditaires. Parmi les EIM, les anomalies de la neurotransmission peuvent affecter, entre autres, la synthèse ou le transport des neurotransmetteurs, notamment les amines biogènes (dopamine et sérotonine) et les folates. La reconnaissance de ces affections est d’une importance capitale pour le diagnostic et le traitement éventuel. L’analyse chimique du liquide céphalo-rachidien (LCR) est incontournable pour le diagnostic de ces pathologies. Or, les méthodes actuelles de dosage ne sont pas simples. Longues et fastidieuses, elles ont été, pendant longtemps, réservées aux laboratoires spécialisés. L’objectif de ce travail était de développer des méthodes simples et rapides de diagnostic des troubles de la neurotransmission et d’établir les valeurs normales fréquentes dans la population française. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de développer une méthode de dosage directe, en une seule étape, de la tetrahydrobioptérine (BH4), cofacteur des hydroxylases intervenant dans la synthèse des amines biogènes, et des ptérines impliquées dans le cycle de synthèse et de dégradation de ce cofacteur, dans le LCR. Auparavant, le dosage de ces substances nécessitait au moins deux analyses chromatographiques précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Par la suite, nous avons développé une méthode de diagnostic rapide, en moins de 10 minutes, par UHPLC (chromatographie liquide à ultra haute performance), couplée à une détection séquentielle par coulométrie et par fluorescence, des troubles dopaminergique et sérotoninergique. Cette méthode permet de doser simultanément, en une seule étape, tous les métabolites de la dopamine, de la sérotonine et de la noradrénaline, ainsi que les ptérines d’intérêt diagnostic, principalement la dihydroneoptérine (NH2) et la dihydrobioptérine (BH2). L’ensemble de ces explorations nécessitait, auparavant, la mise en œuvre d’au moins trois méthodes de dosage par HPLC (chromatographie liquide à haute performance), précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Pour compléter l’exploration du métabolisme de la BH4 et du suivi thérapeutique des troubles de la neurotransmission, nous avons également proposé une méthode de dosage rapide, en une seule étape, par UHPLC, de tous les métabolites et de toutes les ptérines, incluant la BH4. Enfin, une méthode rapide de dosage (moins de 2 minutes), par UHPLC, du 5-méthyltetrahydrofolate dans le LCR a été développée, afin de compléter le diagnostic biologique de l’ensemble des troubles neurologiques visés. L’application des outils ainsi développés à plus de 1400 patients nous a permis d’établir des valeurs normales fréquentes dans la population française ainsi que de poser le diagnostic de quelques déficits enzymatiques. / Inborn errors of metabolism (IEM) consist of a wide range of hereditary metabolic disorders. Among IEM, neurotransmission anomaly can affect the synthesis or the transport of neurotransmitters, notably biogenic amines (dopamine and serotonin) and folates. Early diagnosis of such affections is of utmost importance especially as some of them can be treated effectively. Chemical analysis of cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the diagnosis of neurotransmitter disorders; however, current quantitative methods are tedious and time consuming. For a long time the chemical diagnosis of neurotransmitter disorders has been available only in specialized laboratories. The purpose of this work was to develop simple and fast diagnosis methods of neurotransmitter disorders as well as to establish the reference values in French population. For this purpose, in a first step, we developed a single step direct method of simultaneous quantification of tetrahydrobiopterin (BH4), which is the main cofactor of the hydroxylases involved in biogenic amines syntheses, and the relevant reduced and oxidized forms of pterins involved in the cycle of synthesis – regeneration of BH4. Formerly, the quantification of those compounds required at least two chromatographic methods with two specific sample preparation procedures. Thereafter we developed a method of fast diagnosis in less than 10 minutes of dopaminergic and serotoninergic disorders using UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) hyphenated to a sequential coulometric and fluorimetric detection. With only a simple filtration step as sample preparation procedure, this method enables the simultaneous quantification of all dopamine, serotonin and noradrenaline metabolites as well as dihydroneopterin (NH2) and dihydrobiopterin (BH2), the relevant pterin forms for the complete diagnosis. Formerly, at least three HPLC (high performance liquid chromatography) quantification methods preceeded by three tedious specific sample preparation procedures were required for such a diagnosis. To complete the investigation of BH4 metabolism and the follow up of neurotransmission disorders, we also developed a fast UHPLC method of simultaneous quantification of all the cited metabolites and pterins including BH4. In order to complete the rapid diagnosis of all targeted neurological disorders, we finally developed an UHPLC method of 5-methyltetrahydrofolate quantification in CSF. The application of these analytical tools in more than 1400 CSF samples, collected from patients followed in some Neurology centers located in several French areas covering nearly the entirety of the territory, allowed us to establish the reference values in French population as well as to diagnose several cases of enzymatic deficits.