Abstract Reactive metabolites are believed to be responsible for rare but serious idiosyncratic adverse drug reactions (IADRs) that have led to the withdrawal of numerous drugs from the market. This has resulted in major harm to patients, economic losses for the pharmaceutical companies and represents a serious problem in drug development. Reactive metabolites can be studied by trapping them with suitable nucleophiles, most commonly with glutathione. The glutathione conjugates formed in these reactions can be analyzed with liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS) techniques. In this study, new in vitro methods for the detection and analysis of reactive metabolites were developed. The suitability for reactive metabolite screening of different enzyme sources commonly used in vitro were compared. It was found that sub-cellular fractions yielded significantly larger amounts of glutathione-trapped reactive metabolites as compared to the amounts obtained from intact hepatocytes. Additionally, different metabolites were detected in some cases. Biomimetic metalloporphyrin catalysts were tested for their ability to produce larger amounts of glutathione-trapped metabolites relative to liver S9 fraction incubations. An increase in reactive metabolite production was observed with biomimetic models, but not all of the metabolites produced by liver S9 were observed. The glutathione conjugates of pulegone and of its metabolite menthofuran were analyzed with LC/MS/MS, and the fragmentation spectra of N- and S-/N- di-linked glutathione conjugate were interpreted in detail for the first time. These results will enable more efficient screening of reactive metabolites of furan-containing compounds. Acyl glucuronides are metabolites produced from carboxylic acid-containing compounds and can be reactive. A good correlation was found between the acyl migration half-life and the tendency of a drug to cause IADRs. The carboxylic moiety can also be metabolized to yield acyl coenzyme A (CoA) conjugates that may be more reactive than their corresponding acyl glucuronides. The formation of CoA conjugates and additional conjugates formed from them was found to be more likely with drugs that cause IADRs. / Tiivistelmä Reaktiivisten metaboliittien uskotaan olevan syypää tietyntyyppisiin harvinaisiin, mutta vakaviin idiosynkraattisiin lääkehaittavaikutuksiin, jotka ovat johtaneet useiden lääkeaineiden poistamiseen markkinoilta. Ne ovat aiheuttaneet merkittäviä haittoja potilaille, tappioita lääkeyhtiöille ja ovat vakava ongelma lääkekehityksessä. Reaktiivisia metaboliitteja voidaan tutkia vangitsemalla niitä sopivilla nukleofiileillä, yleisimmin glutationilla. Muodostuneet glutationikonjugaatit voidaan sitten analysoida nestekromatografia / massaspektrometrisin tekniikoin. Tässä tutkimuksessa kehitettiin uusia in vitro tapoja havaita ja analysoida reaktiivisia metaboliitteja. Tavallisimmin käytettyjen entsyymilähteiden soveltuvuutta testattiin reaktiivisten metaboliittien seulontaan. Solufraktioiden havaittiin tuottavan huomattavasti suurempia määriä glutationi-vangittuja reaktiivisia metaboliitteja kuin elävät solut. Lisäksi eri metaboliitteja havaittiin joillekin aineille eri entsyymilähteissä. Biomimeettisen metalliporfyriinikatalyytin kykyä tuottaa suurempia määriä glutationilla vangittuja reaktiivisia metaboliitteja testattiin vertaamalla sitä maksan S9 fraktioon. Vaikka katalyytillä pystyi tuottamaan suurempia määriä reaktiivisia metaboliitteja, kaikkia S9 fraktiossa havaittuja metaboliitteja se ei tuottanut. Pulegonin ja menthofuraanin glutationikonjugaatteja analysoitiin LC/MS/MS tekniikalla ja N- sekä S-/N- sitoutuneiden glutationikonjugaattien pilkkoutumisspektrit tulkittiin tarkasti ensimmäistä kertaa. Tulokset mahdollistavat furaanirenkaan sisältävistä yhdisteistä syntyvien reaktiivisten metaboliittien tehokkaamman seulonnan. Asyyliglukuronit ovat karboksyylihapporyhmän sisältämien yhdisteiden metaboliitteja, jotka voivat olla reaktiivisia. Asyyliglukuronien vaeltamisen puoliintumisajan ja idiosynkraattisten lääkehaittavaikutusten välillä havaittiin selvä korrelaatio. Karboksyylihapporyhmän kanssa voi muodostua myös asyyli koentsyymi A konjugaatteja, jotka voivat olla reaktiivisempia kuin vastaavat asyyliglukuronit. Koentsyymi A ja siitä edelleen syntyviä muita konjugaatteja havaittiin pääasiassa lääkeaineille, joiden todennäköisyys aiheuttaa idiosynkraattisia lääkehaittavaikutuksia oli suurempi.

Abstract Drug metabolism is one of the most important events a drug faces after administration. Traditionally, drug metabolism has only been considered as a major clearance and elimination step in the pharmacokinetics of a drug. However, drug metabolism is also one of the important factors behind safety and toxicity issues in drug discovery and development. Some of the mechanisms behind metabolism-related toxicity we do understand well while others, especially the role of reactive metabolites, need further research. The thesis reviews the role of drug metabolism in the drug discovery and development process from the point of view of metabolism and metabolites. Special emphasis is put on reviewing the metabolism behind human toxicity and safety, and the roles of circulating and reactive metabolites in particular. Ospemifene is a nonsteroidal selective estrogen receptor modulator recently approved for the treatment of vulvar and vaginal atrophy in postmenopausal women with moderate to severe dyspareunia. The present study characterized the in vitro and in vivo metabolism and potential drug interactions of ospemifene. The principal human metabolites were identified and the adequacy nonclinical animal exposure was evaluated. The major human cytochrome P450 enzymes involved in the formation of principal metabolites were also identified and the clinical consequences assessed. Finally, the interaction potential of ospemifene as a cytochrome P450 enzyme inducer or inhibitor was investigated. As a result, ospemifene was considered to be safe drug from a metabolic interaction point of view. This study was part of the drug development program of ospemifene and practically all of the in vitro study data were included in the marketing authorization application of ospemifene. Ospemifene was also a case molecule in the development of new methodologies to study drug metabolism and drug-drug interactions. / Tiivistelmä Lääkeainemetabolia on lääkeaineen farmakokinetiikassa tärkeä puhdistuma- ja eliminaatioaskel, jonka rooli on ymmärretty varsin hyvin. Lääkeainemetabolialla on myös merkittävä vaikutus lääkeaineen toksisuuteen ja lääkkeen käytön turvallisuuteen. Osa lääkeainemetaboliaan liittyvistä toksisuusmekanismeista selvitetty hyvin, mutta erityisesti reaktiivisiin metaboliitteihin liittyvä osa vaatii vielä tutkimusta. Tämän työn kirjallisuusosassa katselmoidaan lääkeainemetabolian merkitystä lääkekehitysprosessissa painottaen erityisesti lääkeainemetabolian sekä reaktiivisten ja verenkierrossa kiertävien metaboliatuoteiden vaikutusta toksisuuteen ihmisellä ja merkitystä turvalliseen lääkkeiden käyttöön. Ospemifeeni on uusi ei-steroidinen selektiivinen estrogeenireseptorimodulaattori, joka on hyväksytty yhdynnänaikaisesta kivusta kärsivien postmenopausaalisten naisten vulvan ja vaginan limakalvojen kuivumisen hoitoon. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ospemifeenin lääkeainemetaboliaa ihmisellä ja koe-eläimillä sekä mahdollisia lääkeinteraktioita. Tutkimuksessa tunnistettiin tärkeimmät metaboliitit ihmisellä ja arvioitiin eläinkokeissa käytettyjen koe-eläinten altistumisen kattavuus niille. Työssä selvitettiin myös tärkeimmät päämetaboliitteja katalysoivat sytokromi P450 -entsyymit ja arvioitiin löydösten kliinistä merkitystä. Lisäksi tutkittiin aiheuttaako ospemifeeni lääkeinteraktioita muille lääkeaineille indusoimalla tai inhiboimalla sytokromi P450 -entsyymejä. Tutkimustulosten perusteella ospemifeenia voidaan pitää lääkeainemetabolian suhteen turvallisena lääkkeenä. Tämä tutkimus oli osa ospemifeenin lääkekehitysohjelmaa ja käytännössä kaikki tutkimustyön in vitro -tietoaineisto oli mukana ospemifeenin myyntilupa-hakemuksissa lääketurvallisuusviranomaisille. Ospemifeenia käytettiin tutkimustyön aikana myös yhtenä esimerkkimolekyylinä kehitettäessä uusia menetelmiä lääkeainemetabolian ja lääkeinteraktioiden tutkimiseen.