Oestrogen receptors (ER) have classically been described as ligand-inducible nuclear transcription factors. The pleiotrophic effects of ER function have a predominant role in the direct regulation of the growth, differentiation and development of tissues of the human reproductive system. There are two ER subtypes, ER and ER which differ in their specificity for ligand and the consequent actions they orchestrate. Moreover, the latter exists in multiple splice variants of which ER is the only fully functional homologue. Research into the underlying differences in subtype responses to ligand has involved examination of the intranuclear dynamics of individual receptor subtypes. Studies into the mobility of ER in response to ligand have exclusively focused on studies of full length ER and ER independently in transfected cell lines. The studies described in this thesis have investigated the kinetics of ER using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) in infected cell lines which lends itself to more precise expression of the subtype of interest. The morphological impact of natural oestrogenic and synthetic ligands on ERs was examined and the influence on the intranuclear dynamics assessed. Further to this, the effect of co-expression of different ER subtype combinations was examined. Studies on the intranuclear mobility of ER have confirmed and extended the findings of others. Previous work on the development of ER agonists and antagonists has been to target specific overexpressing ER subtypes in a physiological setting. In this study, we demonstrated for the first time an overwhelming ER -selective effect in slowing the rate of mobility within the nucleus, suggesting the study of intranuclear dynamics is an important parameter for the examination of efficacy of a compound. Differential responses to ligand based on co-infected partnerships indicate that heterodimerisation has a profound effect in augmenting ligand-dependent regulation and activity.

Les récepteurs AMPAR sont les principaux responsables de la transmission excitatrice rapide dans le système nerveux central, y compris dans les neurones d’hippocampe étudiés ici. Ils sont très dynamiques dans la membrane. Au sein des épines dendritiques, ils peuvent se déplacer par traffic membranaire entre les compartiments intracellulaires et la membrane plasmique. Une fois à la surface, ils se déplacent par diffusion latérale et peuvent s'ancrer réversiblement avec des protéines de la densité postsynaptique ou retourner dans des compartiments endocytaires. Les oligomères Aß augmentent l'endocytose des récepteurs AMPAR, diminuent la densité des épines dendritique et provoquent des défaillances globales dans la transmission synaptique excitatrice. Ces effets, sont englobés dans le terme "synaptotoxicité des oligomères Aß" et sont un domaine principal d'étude de l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. Wnt5a un ligand Wnt endogène connu pour activer la voie non-canonique dans les neurones d'hippocampe, génère une augmentation des courants excitateurs et des aggrégats de PSD95 et protége les neurones contre la synaptotoxicité des oligomères Aβ. Compte tenu du fait que Wnt5a semble contrecarrer les effets nocifs causés par les oligomères Aß, nous avons procédé à l'étude du mécanisme par lequel Wnt5a protège de la synaptotoxicité des oligomères Aβ. Cela nous a conduit à évaluer l'effet de Wnt5a sur l'un des facteurs dans la transmission glutamatergique, la dynamique des récepteurs AMPAR. En utilisant la microscopie à super-résolution dans les neurones d'hippocampe vivants et fixés, nous avons trouvé que Wnt5a module la dynamique et la localisation des récepteurs AMPAR. Plus précisément, Wnt5a stabilise les récepteurs AMPAR dans les sites synaptiques et extrasynaptiques. Ceci est corrélé avec une augmentation de la co-localisation et de l'interaction entre GluA2 et PSD95. Ces effets ne sont exercés que par l'activation non-canonique de la signalisation Wnt, à travers le ligand Wnt5a et non par les effets canoniques de Wnt7a. De manière intéressante, la pré-incubation de Wnt5a prévient la toxicité des oligomères Aß et maintient la dynamique basale des récepteurs AMPAR. Nos données suggèrent que Wnt5a empêche les effets des oligomères Aβ en favorisant leur stabilisation dans les sites synaptiques. / AMPARs (AMPARs) are responsible for most fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system, including hippocampal neurons studied here. AMPARs are highly dynamic in the plasma membrane. Within dendritic spines, they move by membrane trafficking between intracellular compartments and the plasma membrane. Once at the surface, they move through lateral brownian diffusion and can reversibly anchor to postsynaptic density proteins or return to endocytic compartments. Aβ oligomers increase endocytosis of AMPARs, diminish dendritic spine density and cause overall failures in excitatory transmission. These effects, among others, are englobed in the term “Aβ oligomers synaptotoxicity” and are a main focus on the study of Alzheimers disease ethiology. On the contrary, Wnt5a - an endogenous Wnt ligand known to activate the non-canonical pathway in hippocampal neurons - generates an increase in excitatory currents and in clusters of PSD95 and protects neurons against Aβ oligomers synaptotoxicity. Given the fact that Wnt5a seems to counteract the distresses caused by Aβ oligomers, we proceeded to study the mechanism through which Wnt5a protects from Aβ oligomers synaptotoxicity. This led us to evaluate the effect of Wnt5a on one of the important factors in glutamatergic transmission, i.e. AMPAR receptor dynamics. By using super-resolution microscopy in live and fixed hippocampal neurons, we found that Wnt5a modulates the dynamic and localization of AMPARs. Specifically, Wnt5a stabilizes AMPARs in synaptic and extrasynaptic sites. This correlates with an increase in co-localization and interaction between GluA2 and PSD95. These effects are exerted only by non-canonical activation of Wnt signaling, through Wnt5a ligand and not by the canonical effects of Wnt7a. Interestingly, pre-incubation of Wnt5a prevents toxicity of Aβ oligomers and maintains basal AMPARs dynamics. Our data suggest that Wnt5a prevents Aβ oligomers effects by promoting their stabilization in synaptic sites. / Los receptores AMPA (AMPARs) son los principales responsables de la respuesta excitatoria rápida en el sistema nervioso central, incluyendo neuronas hipocampales, estudiadas en esta tesis. A diferencia de otros receptores glutamatérgicos, los AMPARs son altamente dinámicos. Dentro de las espinas dendríticas, se pueden mover hacia y desde compartimentos endocíticos y hacia la membrana plasmática. Una vez en la superficie, a través de difusión lateral, se pueden anclar a proteínas de la densidad postsináptica o regresar a compartimentos endocíticos. Por otro lado, los oligómeros Aβ (oAβ) aumentan la endocitosis de AMPARs, disminuyen la densidad de espinas dendríticas y causan una falla generalizada de la transmisión sináptica excitatoria. Estos efectos, entre otros, se engloban en el término “sinaptotoxicidad por oAβ” y es uno de los principales puntos de estudio en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Al contrario, Wnt5a un ligando endógeno conocido por activar la vía no canónica en neuronas hipocampales, genera un aumento en corrientes excitatorias y en los clusters de PSD95 y protege a las neuronas contra la sinaptotoxicidad causada por oAβ. Debido a esto, procedimos a estudiar el mecanismo por el cual Wnt5a protege de la sinaptotoxicidad causada por Aβ. Esto nos llevó a evaluar los efectos de Wnt5a en uno de los principales factores en la transmisión glutamatérgica, la dinámica de los AMPARs. Con el uso de microscopía de super-resolución en neuronas hipocampales vivas, encontramos que Wnt5a modula la dinámica y localización de los AMPARs. Específicamente, Wnt5a estabiliza los AMPARs en espinas y dendritas. Lo cual se correlaciona con un aumento en la co-localización e interacción entre GluA2 y PSD95. Estos efectos son causados únicamente por la activación no-canónica de la vía Wnt, a través del ligando Wnt5a y no por los efectos canónicos de Wnt7a. De manera interesante, la pre-incubación de Wnt5a previene la toxicicidad de los oligómeros Aβ y mantiene la dinámica basal de los AMPARs. Esta data sugiere que Wnt5a promueve la estabilización de AMPARs, previniendo los efectos synaptotóxicos de los oAβ .

La dynamique structurelle des biomolécules est intimement liée à leur fonction, mais très coûteuse à étudier expériementalement. Pour cette raison, de nombreuses méthodologies computationnelles ont été développées afin de simuler la dynamique structurelle biomoléculaire. Toutefois, lorsque l'on s'intéresse à la modélisation des effects de milliers de mutations, les méthodes de simulations classiques comme la dynamique moléculaire, que ce soit à l'échelle atomique ou gros-grain, sont trop coûteuses pour la majorité des applications. D'autre part, les méthodes d'analyse de modes normaux de modèles de réseaux élastiques gros-grain (ENM pour "elastic network model") sont très rapides et procurent des solutions analytiques comprenant toutes les échelles de temps. Par contre, la majorité des ENMs considèrent seulement la géométrie du squelette biomoléculaire, ce qui en fait de mauvais choix pour étudier les effets de mutations qui ne changeraient pas cette géométrie. Le "Elastic Network Contact Model" (ENCoM) est le premier ENM sensible à la séquence de la biomolécule à l'étude, ce qui rend possible son utilisation pour l'exploration efficace d'espaces conformationnels complets de variants de séquence. La présente thèse introduit le pipeline computationel ENCoM-DynaSig-ML, qui réduit les espaces conformationnels prédits par ENCoM à des Signatures Dynamiques qui sont ensuite utilisées pour entraîner des modèles d'apprentissage machine simples. ENCoM-DynaSig-ML est capable de prédire la fonction de variants de séquence avec une précision significative, est complémentaire à toutes les méthodes existantes, et peut générer de nouvelles hypothèses à propos des éléments importants de dynamique structurelle pour une fonction moléculaire donnée. Nous présentons trois exemples d'étude de relations séquence-dynamique-fonction: la maturation des microARN, le potentiel d'activation de ligands du récepteur mu-opioïde et l'efficacité enzymatique de l'enzyme VIM-2 lactamase. Cette application novatrice de l'analyse des modes normaux est rapide, demandant seulement quelques secondes de temps de calcul par variant de séquence, et est généralisable à toute biomolécule pour laquelle des données expérimentale de mutagénèse sont disponibles. / The dynamics of biomolecules are intimately tied to their functions but experimentally elusive, making their computational study attractive. When modelling the effects of thousands of mutations, time-stepping methods such as classical or enhanced sampling molecular dynamics are too costly for most applications. On the other hand, normal mode analysis of coarse-grained elastic network models (ENMs) provides fast analytical dynamics spanning all timescales. However, the vast majority of ENMs consider backbone geometry alone, making them a poor choice to study point mutations which do not affect the equilibrium structure. The Elastic Network Contact Model (ENCoM) is the first sequence-sensitive ENM, enabling its use for the efficient exploration of full conformational spaces from sequence variants. The present work introduces the ENCoM-DynaSig-ML computational pipeline, in which the ENCoM conformational spaces are reduced to Dynamical Signatures and coupled to simple machine learning algorithms. ENCoM-DynaSig-ML predicts the function of sequence variants with significant accuracy, is complementary to all existing methods, and can generate new hypotheses about which dynamical features are important for the studied biomolecule's function. Examples given are the maturation efficiency of microRNA variants, the activation potential of mu-opioid receptor ligands and the effect of point mutations on VIM-2 lactamase's enzymatic efficiency. This novel application of normal mode analysis is very fast, taking a few seconds CPU time per variant, and is generalizable to any biomolecule on which experimental mutagenesis data exist.