Made available in DSpace on 2016-07-13T19:05:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_cunha_ioc_dout_2015.pdf: 12334433 bytes, checksum: 5e288d54da3b70496ff176f2e68a6290 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Introdução: O CCR2 é o receptor do CCL2/MCP-1. O CCR2 é expresso em monócitos, células endoteliais, neutrófilos ativados, micróglia e astrócitos. Recentemente, alguns estudos mostram a expressão constitutiva do CCR2 e do CCL2 em regiões do sistema nervoso central, como o hipocampo. Como o hipocampo está envolvido com a consolidação de memória, nós analisamos o papel do CCR2 no processo de aprendizado e consolidação de memória. Métodos: Animais geneticamente deficientes para o CCR2 e animais controle foram submetidos a esquiva passiva e a natação forçada, para examinar a memória aversiva e a memória contextual. A resposta motora foi avaliada pelo ensaio de campo aberto, e o reflexo pelo teste de inibição de pré-pulso. Os animais foram submetidos a esquiva passiva de múltiplos treinos para analisar a curva de aprendizado e o esquecimento da memória. O próximo passo foi verificar a expressão de importantes mediadores envolvidos com a consolidação de memória por western blotting, como a ERK fosforilada e BDNF. E o ultimo passo foi verificar se a deficiência do CCR2 afeta a sinapse no hipocampo, pela expressão e co-localização de PSD95 e sinaptofisina por imunohistoquímica e a expressão de sinaptofisina e PSD95 por western blotting. Resultados: A ausência do CCR2, impediu a consolidação de memória aversiva e a memória contextual O animal deficiente para o CCR2 requer mais treinos para aprender na esquiva passiva e a memória decai de forma mais rápida, quando comparado com o grupo controle. A expressão de ERK fosforilada está reduzida 1 hora após um treino na esquiva passiva no hipocampo de animais deficientes para o CCR2 assim como a expressão de BDNF maduro está reduzida 12 horas após um treino na esquiva passiva. Nós observamos que a deficiência do CCR2 afeta a sinapse, com importante redução da co-localização entre sinaptofisina e PSD95 no hipocampo e redução na expressão de sinaptofisina no hipocampo. Os animais CCR2-/- tem aumento da expressão da proteina amilóide beta no hipocampo e no córtex cerebral ao redor dos vasos sanguíneos, associado com redução da perfusão sanguínea no cérebro, redução da expressão de caspases-3 e -12, sem diferença na expressão de IBA-1 e nos níveis de citocinas e quimiocinas no cérebro. Conclusão: A ausência do CCR2 altera a estrutura das sinapses, reduzindo a expressão da proteína pré-sináptica sinaptofisina e PSD95, bem como leva ao acúmulo de proteína amiloide beta no tecido cerebral, culminando com a disfunção cognitiva / Abstract: Background: CCR2 is the receptor for CCL2/MCP-1. CCR2 is expressed in monocytes, endothelial cells, activated neutrophils, microglial cells and astrocytes. Some studies show the constitutive expression of CCR2 and CCL2/MCP-1 in specific areas of the central nervous system, such as the hippocampus. Because the hippocampus is important for memory consolidation, we studied the role of CCR2 in learning process and in memory consolidation. Methods: CCR2 deficient mice and wild type were submitted to passive avoidance test and to water maze test, to evaluate aversive memory and contextual memory, respectively. The motor response was evaluated by open field test, while the reflex was evaluated by pre-pulse inhibitory response. The animals were submitted to passive avoidance test of multiple trials, to analyze the learning curve and the retrieval of memory. The next step was to verify the expression of proteins involved with memory consolidation, such as the phosphorylated ERK and mature BDNF by western blotting,. And the last step was to verify if the CCR2 deficiency affect the synapsis in hippocampus, by the expression and co-localization of PSD95 and synaptophysin using immunohistochemistry and the expression of synaptophysin and PSD95 by western blotting. Results: The absence of CCR2, impaired consolidation of aversive and contextual memories The CCR2 deficient mice required more trials to learn in passive avoidance test and the memory decay was faster, when compared to the wild type group. The expression of phosphorylated ERK is decreased 1 hour after one trial in passive avoidance test in the hippocampus of CCR2 deficient mice as was the expression of mature BDNF 12 hours after one trial in passive avoidance test. We observed that the deficiency of CCR2 affects the synapsis, with an important decrease in co-localization of PSD95 and synaptophysin in the hippocampus and decreased expression of synaptophysin in the hippocampus of CCR2 deficient mice. CCR2-/- animal had increased expression of beta amyloid protein around the blood vessels in the hippocampus and in the cortex, associated with decreased brain perfusion, increased expression of caspase-12 and caspase-3, but no difference in the expression of IBA-1 and in cytokines and chemokines levels. Conclusions: Absence of CCR2 changes the structure of synapsis, decreasing the pre-synaptic protein synaptophysin in hippocampus and also lead to accumulation of beta amyloid protein in brain tissue, culminating with cognitive dysfunction

Introdução: A nefrite lúpica (NL) é o maior preditor de morbidade e mortalidade em pacientes portadores de lupus eritematoso sistêmico. Recentes estudos mostram que a proteína quimiotática de monócitos (MCP-1) está implicada na ativação de células inflamatórias, afetando a progressão e a severidade da NL, e que a excreção urinária do MCP-1 (uMCP-1) está aumentada em pacientes com NL em atividade. Na literatura os dados sobre o polimorfismo do gene MCP-1 A(-2518)G e do seu receptor CCR2 V(-64)I sobre a susceptibilidade para nefrite lúpica ainda estão em discussão. Objetivos: Avaliar a associação entre o polimorfismo do gene MCP-1 e do seu receptor CCR2 em pacientes com NL e indivíduos saudáveis, além da associação de ambos os polimorfismos com parâmetros clínicos e histológicos nos pacientes portadores de NL. Além disso, avaliar a associação entre a excreção urinária do MCP-1 em pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade com parâmetros clínicos e histológicos. Pacientes e Métodos: As genotipagens do MCP-1 e do CCR2 foram realizadas em 197 pacientes com nefrite lúpica através da extração do DNA genômico, seguido da técnica de reação em cadeia da polimerase, utilizando-se primers específicos. A dosagem urinária do MCP-1 foi realizada em 34 pacientes com nefrite lúpica em atividade através da técnica de ELISA. Resultados: Foram estudados 197 pacientes portadores de nefrite lúpica, do sexo feminino, com idade média de 28±9,8 anos, sendo 65,5% de etnia branca e 34,5% não-branca, acompanhados em nosso ambulatório durante o período de 69±37,1 meses. Como grupo controle, utilizou-se um grupo de 220 indivíduos saudáveis do sexo feminino, pareados de acordo com idade e etnia. Quanto à distribuição do genótipo do MCP-1, evidenciou-se que a freqüência do genótipo GG foi significativamente maior nos pacientes portadores de nefrite lúpica quando comparado ao grupo controle (12,7%x5,0%) (p=0,019), enquanto que o genótipo AA apresentou maior freqüência no grupo controle, porém sem significância estatística (48,7%x56,8%). Com relação aos alelos, a freqüência do alelo A foi significativamente maior no grupo controle (75,9%x68%) (p=0,007) quando comparada aos pacientes com NL. Já em relação ao polimorfismo do CCR2, não foi observada nenhuma diferença na freqüência do genótipo entre os dois grupos, porém foi observada maior freqüência do alelo V no grupo controle (89,8%x86,3%) (p=0,046). Não houve associação entre o genótipo e alelos do MCP-1 e do CCR2 com a função renal no início e no final do estudo, marcadores imunológicos, manifestações clínicas (SLEDAI) e a classe histológica. Porém, observou-se um predomínio significante dos flares moderado e grave nos pacientes portadores dos genótipos AA e AG (p< 0,05) em relação ao genótipo GG, enquanto que, em relação à distribuição alélica do MCP-1 e ao CCR2, não se notou diferença estatística. Não se evidenciou diferença estatística entre as curvas de sobrevida renal funcional dos pacientes portadores de nefrite lúpica e os genótipos do MCP-1 e CCR2 e seus respectivos alelos. Notou-se diferença estatística na variação da creatinina sérica ao longo do seguimento (p<0,001). Foram também estudados 34 pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade, do sexo feminino, com idade média de 28,4 ± 9,9 anos, sendo 26,5% pacientes de etnia branca e 73,5% de etnia não-branca. A dosagem do MCP-1 urinário foi realizada no início do quadro e após 3 e 6 meses de seguimento. Em relação ao uMCP-1, houve um aumento significante do mesmo no início do quadro renal quando comparado com 3 e 6 meses de tratamento (p<0,05). Evidenciou-se um aumento do uMCP-1 nos pacientes que apresentavam creatinina plasmática inicial > 1,2mg/dl (p<0,05), porém não houve associação entre uMCP-1 e a creatinina após 6 meses de tratamento. Não se observou associação entre os níveis de uMCP-1 com as manifestações clínicas (SLEDAI), classe histológica e marcadores imunológicos, exceto quanto ao anticorpo antifosfolípide, pois houve excreção aumentada do uMCP-1 em pacientes com anticorpo antifosfolípide positivo no início do quadro (p<0,05). Notou-se valores elevados do uMCP-1 nos pacientes que apresentaram flares grave e moderado em relação ao flare leve (p<0,05). Quanto à distribuição genotípica do MCP-1 em relação ao uMCP-1, foi observado uma associação do uMCP-1 em pacientes portadores dos genótipos AG e AA quando comparados ao genótipo GG (p<0,05). Já em relação à distribuição genotípica e alélica do CCR2, não se notou nenhuma diferença na freqüência dos mesmos e a dosagem de uMCP-1. Conclusões: Houve uma significante associação do genótipo GG do polimorfismo do MCP-1 em pacientes portadoras de NL na população estudada, além de uma associação entre os níveis do uMCP-1 com a severidade do flare renal e a função renal nas pacientes portadoras de NL. / Introduction: Lupus Nephritis (LN) contributes substantially to morbidity and mortality in patients with systemic lupus erythematosus. Literature data show monocyte chemoattractant protein (MCP-1) is implicated in the activation of inflamatory cells and has been suggested to affect the progression and severity of lupus nephritis and urinary MCP-1 levels (uMCP-1) are increased in LN patients during active renal disease. Literature data about genotype polymorphism of MCP-1 A(-2518)G and of its receptor CCR2 V(-64)I and susceptibility to LN is still open to discussion. Objectives: The aim of our protocol was to study association of the genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 with LN compared to a healthy matched population and study association these polymorphisms with clinical and histological parameters in LN patients. Moreover, investigate the relationship of uMCP-1 on the onset, severity and resolution of LN flare. Patients and Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral leukocytes from 197 LN patients and MCP-1 and CCR2 genomic variants were detected by polymerase chain reaction followed by restriction enzyme-fragment analysis. uMCP-1 levels were mesured by enzyme-linked immunosorbent assay from 34 LN flare patients. Results: One hundred and ninety seven (197) female patients with histological diagnosis de LN undergoing follow up in our institution and 220 ethnically matched healthy controls were enrolled in this study. Epidemiological characteristics of the LN group were: age 28±9.8 years, race 65.5% of caucasians and 34.5% of Brazilian afro-south-latins. Baseline values were collected at the onset of LN and final values in their last follow up (69±37.1 months). There was a significant association of the GG genotype polymorphism of MCP-1 with LN patients compared to controls (12.7%x5.0%) (p=0.019), while the allele A distribuition was associated with healthy controls (75.9%x68%) (p=0.007). Considering CCR2 -64 V/I polymorphism genotype there was a association of the allele V with the control group compared to LN (89.8%x86.3%) (p=0.046). Analyzing genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 there werent correlation with renal function, immunological markers, clinical manifestations (SLEDAI) or histological classes of LN. There was a significant association of the AA and AG genotypes polymorphism of MCP-1 with moderate and severe renal flares compared to GG genotype polymorphism of MCP-1 (p< 0.05). Kaplan-Meier analysis of the renal survival curves with respect to the studied genotypes did not show any influence in the progression of renal disease. There was a significant association of the creatinine onset and on follow up (p<0.001). Thrity four (34) female patients with criteria for active LN and histological diagnosis were enrolled and treated for six months. Each patient was evaluated once a month and uMCP-1 bimonthly. Epidemiological characteristics of the group showed: age 28.4±9.9 years and race 26.5% caucasians and 73.5% Brazilian afro-south-latins. uMCP-1 excretion at onset (T0) of LN was significantly increased when compared to uMCP-1 measured on the third (T3) and sixth months (T6) (p<0.05). Analyzing uMCP-1 values on T0 there was a correlation with creatinine (p<0,05), but not with, clinical manifestations histological classes of LN or immunological markers, except in patients with positive antiphospholipid autoantibodies demonstrated increased of uMCP-1 (p<0.05). Otherwise, uMCP-1 levels were associated with seriousness of nephritis flares, severe and moderate over mild (p<0.05). Considering MCP-1 polymorphism genotype there was association of the AA and AG genotypes with increased uMCP-1 in patients with active renal disease (p<0.05). Conclusions: There is a significant association of the GG genotype of MCP-1 -2518 A/G polymorphism with LN in our population. uMCP-1 levels in LN is associated with flare seriousness and renal function.

Introdução: A nefrite lúpica (NL) é o maior preditor de morbidade e mortalidade em pacientes portadores de lupus eritematoso sistêmico. Recentes estudos mostram que a proteína quimiotática de monócitos (MCP-1) está implicada na ativação de células inflamatórias, afetando a progressão e a severidade da NL, e que a excreção urinária do MCP-1 (uMCP-1) está aumentada em pacientes com NL em atividade. Na literatura os dados sobre o polimorfismo do gene MCP-1 A(-2518)G e do seu receptor CCR2 V(-64)I sobre a susceptibilidade para nefrite lúpica ainda estão em discussão. Objetivos: Avaliar a associação entre o polimorfismo do gene MCP-1 e do seu receptor CCR2 em pacientes com NL e indivíduos saudáveis, além da associação de ambos os polimorfismos com parâmetros clínicos e histológicos nos pacientes portadores de NL. Além disso, avaliar a associação entre a excreção urinária do MCP-1 em pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade com parâmetros clínicos e histológicos. Pacientes e Métodos: As genotipagens do MCP-1 e do CCR2 foram realizadas em 197 pacientes com nefrite lúpica através da extração do DNA genômico, seguido da técnica de reação em cadeia da polimerase, utilizando-se primers específicos. A dosagem urinária do MCP-1 foi realizada em 34 pacientes com nefrite lúpica em atividade através da técnica de ELISA. Resultados: Foram estudados 197 pacientes portadores de nefrite lúpica, do sexo feminino, com idade média de 28±9,8 anos, sendo 65,5% de etnia branca e 34,5% não-branca, acompanhados em nosso ambulatório durante o período de 69±37,1 meses. Como grupo controle, utilizou-se um grupo de 220 indivíduos saudáveis do sexo feminino, pareados de acordo com idade e etnia. Quanto à distribuição do genótipo do MCP-1, evidenciou-se que a freqüência do genótipo GG foi significativamente maior nos pacientes portadores de nefrite lúpica quando comparado ao grupo controle (12,7%x5,0%) (p=0,019), enquanto que o genótipo AA apresentou maior freqüência no grupo controle, porém sem significância estatística (48,7%x56,8%). Com relação aos alelos, a freqüência do alelo A foi significativamente maior no grupo controle (75,9%x68%) (p=0,007) quando comparada aos pacientes com NL. Já em relação ao polimorfismo do CCR2, não foi observada nenhuma diferença na freqüência do genótipo entre os dois grupos, porém foi observada maior freqüência do alelo V no grupo controle (89,8%x86,3%) (p=0,046). Não houve associação entre o genótipo e alelos do MCP-1 e do CCR2 com a função renal no início e no final do estudo, marcadores imunológicos, manifestações clínicas (SLEDAI) e a classe histológica. Porém, observou-se um predomínio significante dos flares moderado e grave nos pacientes portadores dos genótipos AA e AG (p< 0,05) em relação ao genótipo GG, enquanto que, em relação à distribuição alélica do MCP-1 e ao CCR2, não se notou diferença estatística. Não se evidenciou diferença estatística entre as curvas de sobrevida renal funcional dos pacientes portadores de nefrite lúpica e os genótipos do MCP-1 e CCR2 e seus respectivos alelos. Notou-se diferença estatística na variação da creatinina sérica ao longo do seguimento (p<0,001). Foram também estudados 34 pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade, do sexo feminino, com idade média de 28,4 ± 9,9 anos, sendo 26,5% pacientes de etnia branca e 73,5% de etnia não-branca. A dosagem do MCP-1 urinário foi realizada no início do quadro e após 3 e 6 meses de seguimento. Em relação ao uMCP-1, houve um aumento significante do mesmo no início do quadro renal quando comparado com 3 e 6 meses de tratamento (p<0,05). Evidenciou-se um aumento do uMCP-1 nos pacientes que apresentavam creatinina plasmática inicial > 1,2mg/dl (p<0,05), porém não houve associação entre uMCP-1 e a creatinina após 6 meses de tratamento. Não se observou associação entre os níveis de uMCP-1 com as manifestações clínicas (SLEDAI), classe histológica e marcadores imunológicos, exceto quanto ao anticorpo antifosfolípide, pois houve excreção aumentada do uMCP-1 em pacientes com anticorpo antifosfolípide positivo no início do quadro (p<0,05). Notou-se valores elevados do uMCP-1 nos pacientes que apresentaram flares grave e moderado em relação ao flare leve (p<0,05). Quanto à distribuição genotípica do MCP-1 em relação ao uMCP-1, foi observado uma associação do uMCP-1 em pacientes portadores dos genótipos AG e AA quando comparados ao genótipo GG (p<0,05). Já em relação à distribuição genotípica e alélica do CCR2, não se notou nenhuma diferença na freqüência dos mesmos e a dosagem de uMCP-1. Conclusões: Houve uma significante associação do genótipo GG do polimorfismo do MCP-1 em pacientes portadoras de NL na população estudada, além de uma associação entre os níveis do uMCP-1 com a severidade do flare renal e a função renal nas pacientes portadoras de NL. / Introduction: Lupus Nephritis (LN) contributes substantially to morbidity and mortality in patients with systemic lupus erythematosus. Literature data show monocyte chemoattractant protein (MCP-1) is implicated in the activation of inflamatory cells and has been suggested to affect the progression and severity of lupus nephritis and urinary MCP-1 levels (uMCP-1) are increased in LN patients during active renal disease. Literature data about genotype polymorphism of MCP-1 A(-2518)G and of its receptor CCR2 V(-64)I and susceptibility to LN is still open to discussion. Objectives: The aim of our protocol was to study association of the genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 with LN compared to a healthy matched population and study association these polymorphisms with clinical and histological parameters in LN patients. Moreover, investigate the relationship of uMCP-1 on the onset, severity and resolution of LN flare. Patients and Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral leukocytes from 197 LN patients and MCP-1 and CCR2 genomic variants were detected by polymerase chain reaction followed by restriction enzyme-fragment analysis. uMCP-1 levels were mesured by enzyme-linked immunosorbent assay from 34 LN flare patients. Results: One hundred and ninety seven (197) female patients with histological diagnosis de LN undergoing follow up in our institution and 220 ethnically matched healthy controls were enrolled in this study. Epidemiological characteristics of the LN group were: age 28±9.8 years, race 65.5% of caucasians and 34.5% of Brazilian afro-south-latins. Baseline values were collected at the onset of LN and final values in their last follow up (69±37.1 months). There was a significant association of the GG genotype polymorphism of MCP-1 with LN patients compared to controls (12.7%x5.0%) (p=0.019), while the allele A distribuition was associated with healthy controls (75.9%x68%) (p=0.007). Considering CCR2 -64 V/I polymorphism genotype there was a association of the allele V with the control group compared to LN (89.8%x86.3%) (p=0.046). Analyzing genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 there werent correlation with renal function, immunological markers, clinical manifestations (SLEDAI) or histological classes of LN. There was a significant association of the AA and AG genotypes polymorphism of MCP-1 with moderate and severe renal flares compared to GG genotype polymorphism of MCP-1 (p< 0.05). Kaplan-Meier analysis of the renal survival curves with respect to the studied genotypes did not show any influence in the progression of renal disease. There was a significant association of the creatinine onset and on follow up (p<0.001). Thrity four (34) female patients with criteria for active LN and histological diagnosis were enrolled and treated for six months. Each patient was evaluated once a month and uMCP-1 bimonthly. Epidemiological characteristics of the group showed: age 28.4±9.9 years and race 26.5% caucasians and 73.5% Brazilian afro-south-latins. uMCP-1 excretion at onset (T0) of LN was significantly increased when compared to uMCP-1 measured on the third (T3) and sixth months (T6) (p<0.05). Analyzing uMCP-1 values on T0 there was a correlation with creatinine (p<0,05), but not with, clinical manifestations histological classes of LN or immunological markers, except in patients with positive antiphospholipid autoantibodies demonstrated increased of uMCP-1 (p<0.05). Otherwise, uMCP-1 levels were associated with seriousness of nephritis flares, severe and moderate over mild (p<0.05). Considering MCP-1 polymorphism genotype there was association of the AA and AG genotypes with increased uMCP-1 in patients with active renal disease (p<0.05). Conclusions: There is a significant association of the GG genotype of MCP-1 -2518 A/G polymorphism with LN in our population. uMCP-1 levels in LN is associated with flare seriousness and renal function.