Erlangen-Nürnberg, Univ., Diss., 2010.

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2009.

Universiẗat, Diss., 1999--Köln.

Zugl.: Berlin, Techn. Univ., Diss., 2009

Univ., Diss.--München, 1998.

Techn. Universiẗat, Diss., 2001--Dresden.

Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

University, Diss., 2005--Düsseldorf.

Die Familie der NFAT-Transkriptionsfaktoren (NFATc1-c4) ist im Zuge einer Immunreaktion endscheidend an der transkriptionellen Regulation der Genexpression beteiligt. Wurden NFAT-Faktoren zunächst als T-zell-spezifische Aktivatoren von Zytokinpromotoren beschrieben, so hat sich inzwischen gezeigt, dass sie in einer Vielzahl von Geweben eine wichtige Rolle spielen. Als Beispiele seien die Herzklappenentwicklung, die Bildung von Blutgefässen, die Ausbildung neuronaler Axone oder die Osteoklastendifferenzierung genannt [10, 24]. In der hier vorliegenden Arbeit zeigen wir, dass die starke Expression der kurzen Isoform NFATc1/αA in Effektor-T-Lymphozyten durch die induzierbare Aktivität des Promoters P1 kontrolliert wird. Die P1 Aktivierung führt zum Splicing des Exon 1 zu 3 (α-Isoformen) und endet meist durch Benutzung der Polyadenylierungsstelle pA1 hinter Exon 9 (A-Isoformen). Der zweite, schwächerer Promoter P2 befindet sich vor dem zweiten Exon und ist für die konstitutive Synthese der β-Isoformen verantwortlich. Der Transkriptionstart am zweiten Exon geht meist mit der Benutzung einer zweiten, hinter dem 11. Exon gelegenen Polyadenylierungsstelle pA2 einher, die durch alternatives Splicing zur Synthese der Isoformen B und C führt. Insgesamt können so vom nfatc1-Lokus sechs verschiedene Isoformen (αA, αB, αC, βA, βB und βC) generiert werden. Die induzierbare Aktivität des P1-Promoters ist, im Gegensatz zum eher konstitutiv aktiven P2-Promoter, NFAT-abhängig und somit eine Form der Autoregulation. In ruhenden T-Lymphozyten sind einzig die Transkripte der NFATc1/β-Isoformen nachweisbar. Nach einer T-Zell-Aktivierung nimmt ihre Häufigkeit dann ab, während nun die α-Isoformen dominant werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass es nach Induktion primärer Effektor-T-Helfer-Zellen oder in T-Zell-Linien zu einer 15-20-fachen Akkumulation der NFATc1/αA mRNA bzw. einer 2-5-fachen Zunahme der NFATc1/αB und C mRNAs kommt. Zur maximalen Induktion des P1-Promotors bedarf es zum einen eines anhaltenden Anstiegs der intrazellulären Kalziumkonzentration, die zur Aktivierung der Phosphatase Calcineurin und damit zur Kernlokalisation der NFAT-Faktoren führt. Zum anderen ist die Aktivierung der Proteinkinase C-Enzyme und der MAP-Kinasen notwendig, wie sie durch Phorbolester in der Zelle vermittelt wird. Dies lässt darauf schließen, dass für eine optimale Aktivierung des P1-Promotors sowohl Signale des T-Zell-Rezeptors als auch Signale von Korezeptoren - wie von CD28 - notwendig sind. Da die Induktion von NFATc1/αA in NFATc2/NFATc3 doppeldefizienten Mäusen normal erfolgt, kann man schlussfolgern, dass NFATc1 in Form einer Autoregulation die Aktivität des P1-Promoters und damit die Synthese der α-Isoformen kontrolliert. Die NFAT-vermittelte Aktivierung des P1-Promoters erfolgt über zwei tandemartig angeordnete NFAT-Bindungsstellen der Nukleotidsequenz TGGAAA, an die jeweils ein NFAT-Protein binden kann. Daneben enthält der Promoter konservierte Bindemotive für CREB-, AP-1, Sp-, NF-kB- und GATA-Faktoren, die wahrscheinlich an der komplexen Kontrolle dieses induzierbaren NFATc1-Promoters beteiligt sind. Zusammengefasst ergibt sich aus diesen Daten das folgende Modell. Die Transkription im nfatc1-Genlokus erfolgt in naiven und in ruhenden Effektor-T-Zellen konstitutiv und gesteuert durch den P2-Promotor. In Folge einer Aktivierung der Zelle verringert sich die Aktivität des P2-Promotors, während gleichzeitig der P1-Promotor induziert wird, der zusammen mit einer verstärkten Nutzung der pA1-Polyadenylierungssequenz für die massive Zunahme der NFATc1/αA-Isoform verantwortlich ist. Dies deutet auf eine besondere Bedeutung dieser kurzen Isoform in der Effektorphase der T-Zell-Aktivierung hin, insbesondere in Th1-Zellen, die NFATc1/αA in hohen Konzentrationen produzieren. / NFAT transcription factors play critical roles in gene transcription during immune responses. Besides regulation of lymphokine promoters in T lymphocytes, NFAT factors are also expressed in other cell types and regulate the activity of numerous genes that control the generation of cardiac septa and valves in embryonic heart, the formation of blood vessels, the outgrowth of neuronal axons and the differentiation of osteoclasts during bone formation [10, 24]. Here we show that the induction of NFATc/αA in effector T cells is controlled by a strong inducible promoter, P1. It results in splicing of exon 1 to exon 3 transcripts and, in concert with the activity of a poly A site downstream of exon 9, leads to the massive synthesis of NFATc/αA in effector Th1 cells. A second, weak promoter, P2, lies in front of exon 2 and directs the synthesis of longer NFAT β isoforms. Both P1 and P2 direct the synthesis of three different RNAs: αA, αB, αC and βA, βB, βC correspondingly. The B and C isoforms arise from alternative splicing and poly A addition at the distal site pA2. P1 but not P2 activity is autoregulated by NFAT factors which bind to two tandemly arranged NFAT sites within P1 and enhance its induction. In resting T cells, the NFATc1/β RNAs are the most prominent nfatc1 transcripts and their synthesis is reduced upon T-cell activation. However, following activation in primary effector T cells or in T-cell lines of human or murine origin, a 15–20-fold induction of NFATc1/αA RNA was detected, whereas only a 2–5-fold increase was observed for the NFATc1/αB or NFATc1/αC RNAs. Optimal induction of P1 promoter require involving of a persistent increase in free cytosolic Ca2+ induced by ionomycin, which stimulates the nuclear translocation and transcriptional activation of all NFATc factors and phorbol esters, which activate protein kinase C and other protein kinase pathways in T cells. This suggests that both TCR and co-receptor signals contribute to give full P1 nfatc1 induction. Because NFATc1/αA induction is unaffected in NFATc2+c3 double-deficient T cells, NFATc1 autoregulates its own synthesis by controlling P1 activity and NFATc1/αA induction. P1 promoter contains tandemly arranged NFAT core binding motif TGGAAA to witch bind monomeric NFATc1 proteins and numerous conservative binding sites of other transcriptional factors like CREB, Fos, ATF-2, Sp1, NF-kB and GATA suggesting complex multi-factor regulation of NFATc1 gene. We also highlight that initial phase of nfatc1 transcription in naive CD4+ T cells is controlled by the promoter P2 which is constitutively active in resting T cells. The activation of resting T cells results in a decrease of P2 and the induction of P1 activity and, under optimal conditions, in the predominant synthesis of NFATc1/αA in effector T cells. In addition to the high concentrations of poly A factors required for optimal pA1 function, the levels of transcription factors, in particular NFATs, must also increase for P1 induction. That could be explained by achievement of certain threshold levels for transcriptional activation. Finally, the altered transactivation potential of NFATc1/αA suggests a specific role for this NFATc1 protein in gene control, such as in Th1 effector cells where NFATc1/αA is synthesized at high concentrations.