Copy Number Variants (CNVs) are defined as DNA segments of 1kb or more in length and present in a variable number of copies in the human genome. It has been recently shown that many human genetic diseases including organ malformations are caused by CNVs in a patient's genome. However, the genetic and molecular basis for Renal Agenesis (RA), which is a medical condition whereby unilateral or bilateral fetal kidneys fail to develop, has not yet been extended to CNV studies. By using array-based Comparative Genomic Hybridization, we are analyzing DNA from patients who have RA in order to identify CNVs that are causative for RA; genes within the CNVs will then be assessed for their potential involvement in RA by altering their dose in Xenopus embryos.

No description available.

During the Human Genome Project the first hundred billion bases were sequenced in four years, however, the second hundred billion bases were sequenced in four months (NHGRI, 2013). As efforts were made to improve every aspect of sequencing in this project, cost became inversely proportional to the speed (NHGRI, 2013). Human Genome Project ended in April 2003 but research in faster and cheaper ways to sequence the DNA is active to date (NHGRI, 2013). On the one hand, these advancements have allowed the convenient and unbiased generation and interrogation of a variety of omics datasets; on the other hand, they have substantially contributed towards the ever-increasing size of biological data. Therefore, informatics techniques are indispensable tools in the field of biology and medicine due to their ability to efficiently store and probe large datasets. Bioinformatics is a specialized domain under informatics that focusses on biological data storage, organization and analysis (NHGRI, 2013). Here, I have applied informatics approaches such as database designing and web development in the context of biological datasets or bioinformatics, to create a novel web-based resource that allows users to explore the comprehensive transcriptome of common aquatic tunicate named Oikopleura dioica (O .dioica), and access their associated annotations across key developmental time points, conveniently. This unique resource will substantially contribute towards studies on development, evolution and genetics of chordates using O. dioica as a model. Mendelian or single-gene disorders such as cystic fibrosis, sickle-cell anemia, Huntington’s disease, and Rett’s syndrome run across generations in families (Chial, 2008). Allelic variations associated with Mendelian disorders primarily reside in the protein-coding regions of the genome, collectively called an exome (Stenson et al., 2009). Therefore, sequencing of exome rather than whole genome is an efficient and practical approach to discover etiologic variants in our genome (Bamshad et al., 2011). Renal agenesis (RA) is a severe form of congenital anomalies of the kidney and urinary tract (CAKUT) where children are born with one (unilateral renal agenesis) or no kidneys (bilateral renal agenesis) (Brophy et al., 2017; Yalavarthy & Parikh, 2003). In this study, we have applied exome-sequencing technique to selective human patients in a renal agenesis (RA) pedigree that followed a Mendelian mode of disease transmission. Exome sequencing and molecular techniques combined with my bioinformatics analysis has led to the discovery of a novel RA gene called GREB1L (Brophy et al., 2017). In this study, we have successfully demonstrated the validation of exome sequencing and bioinformatics techniques to narrow down disease-associated mutations in human genome. Additionally, the results from this study has substantially contributed towards understanding the molecular basis of CAKUT. Discovery of novel etiologic variants will enhance our understanding of human diseases and development. High-throughput sequencing technique called RNA-Seq has revolutionized the field of transcriptome analysis (Z. Wang, Gerstein, & Snyder, 2009). Concisely, a library of cDNA is prepared from a RNA sample using an enzyme called reverse transcriptase (Nottingham et al., 2016). Next, the cDNA is fragmented, sequenced using a sequencing platform of choice and mapped to a reference genome, assembled transcriptome, or assembled de novo to generate a transcriptome (Grabherr et al., 2011; Nottingham et al., 2016). Mapping allows detection of high-resolution transcript boundaries, quantification of transcript expression and identification of novel transcripts in the genome. We have applied RNA-Seq to analyze the gene expression patterns in water flea otherwise known as D. pulex to work out the genetic details underlying heavy metal induced stress (unpublished) and predator induced phenotypic plasticity (PIPP) (Rozenberg et al., 2015), independently. My bioinformatics analysis of the RNA-Seq data has facilitated the discovery of key biological processes participating in metal induced stress response and predator induced defense mechanisms in D. pulex. These studies are great additions to the field of ecotoxicogenomics, phenotypic plasticity and have aided us in gaining mechanistic insight into the impact of toxicant and predator exposure on D. pulex at a bimolecular level.

Εισαγωγή: Το σύνδρομο της μεμονωμένης ανεπάρκειας της εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών (IGD) χαρακτηρίζεται από μεμονωμένη λειτουργική ανεπάρκεια της υποθαλαμικής παραγωγής ή/και έκκρισης της GnRH οδηγώντας σε μεμονωμένη ανεπάρκεια των γοναδοτροπινών με φυσιολογική λειτουργικότητα των υπολοίπων υποφυσιακών ορμονών. Η συνύπαρξη IGD και ανοσμίας αναφέρεται ως σύνδρομο Kallmann (ΣΚ), ενώ η απουσία οσφρητικής διαταραχής αναφέρεται ως ιδιοπαθής υπογοναδοτροφικός υπογοναδισμός (ΙΥΥ). Σκοπός: Σκοπός της μελέτης είναι η περιγραφή των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών ασθενών με μεμονωμένη ανεπάρκεια GnRH (ΙΥΥ και ΣΚ), η διερεύνηση της ύπαρξης μεταλλάξεων στα γονίδια KAL1, FGFR1 (υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών 1), PROK2 (προκινετισίνη 2), PROKR2 (υποδοχέας της προκινετισίνης 2) και GPR54 (KISS1R: υποδοχέας της κισσπεπτίνης) στους ασθενείς αυτούς, καθώς και η συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου των ασθενών και ειδικών κλινικών φαινοτύπων. Επίσης διερευνείται η παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο KAL1 σε ομάδα φαινομενικά υγιών παιδιών με ετερόπλευρη αγενεσία/δυσγενεσία νεφρού (ΕΝΑ), σε μια προσπάθεια καθορισμού της συχνότητας των μεταλλάξεων του γονιδίου KAL1 στην ΕΝΑ. Τέλος πραγματοποιείται in-vitro λειτουργικός έλεγχος δύο σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου FGFR1 που επηρεάζουν το ίδιο αμινοξύ της πρωτεΐνης (R254W και R254Q), με στόχο τη συσχέτιση των in-vitro ευρημάτων με τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών. Ασθενείς: Μελετήθηκαν συνολικά εξήντα έξι (66) ασθενείς με μεμονωμένη ανεπάρκεια GnRH (26 με ΣΚ και 40 με ΙΥΥ), στους οποίους πραγματοποιήθηκε μοριακός έλεγχος των γονιδίων KAL1, FGFR1, PROK2, PROKR2 και GPR54. Επίσης μελετήθηκαν 13 παιδιά (ηλικίας κάτω των 15 ετών) στα οποία υπήρχε απεικονιστικά επιβεβαιωμένη συγγενής ετερόπλευρη νεφρική αγενεσία/δυσγενεσία, η οποία δεν παρατηρήθηκε στα πλαίσια γνωστού συνδρόμου και τα οποία ελέχθησαν για την παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο KAL1. Μέθοδοι: Η μεθοδολογία του μοριακού γονιδιακού ελέγχου περιλάμβανε την απομόνωση DNA γονιδιώματος από δείγμα ολικού αίματος, τον εκλεκτικό πολλαπλασιασμό των εξονίων των υπό μελέτη γονιδίων με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR amplification) και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA στα προϊόντα της PCR (DNA sequencing). Ο in-vitro λειτουργικός έλεγχος των δύο μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα FGFR1 (R254W και R254Q) περιλάμβανε την μελέτη της σηματοδοτικής δραστηριότητας του υποδοχέα κατόπιν διέγερσής του από τον προσδέτη FGF2, καθώς και τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα FGFR1, τα οποία συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα του φυσιολογικού υποδοχέα (WT=wild type). Η μετάδοση σήματος του υποδοχέα FGFR1 αξιολογήθηκε με την τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης. Η μέτρηση των επιπέδων της ολικής έκφρασης του FGFR1 πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ανάλυσης πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου, ακολουθούμενη από την τεχνική της ανάλυσης κατά Western. Η εκτίμηση της ενδοκυττάριας ωρίμανσης του πρωτεϊνικού μορίου του υποδοχέα FGFR1 έγινε μέσω ενζυμικής πέψης της γλυκοπρωτεΐνης με ενδογλυκοσιδάσες, ενώ ο υπολογισμός των επιπέδων έκφρασης του FGFR1 στην κυτταροπλασματική μεμβράνη έγινε με την πρόσδεση ραδιοσημασμένου αντισώματος (radiolabelled antibody binding assay). Αποτελέσματα: Εκ του μοριακού γονιδιακού ελέγχου που πραγματοποιήθηκε στους ασθενείς με IGD εντοπίσθηκαν πέντε διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο KAL1 σε τρεις άρρενες ασθενείς με σύνδρομο Kallmann (Ε514Κ, Α660Τ, Ε37Κ, T235S, έλλειψη εξονίων 5-10), καθώς και μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο FGFR1 (R254W) σε έναν άρρενα ασθενή με ιδιοπαθή υπογοναδοτροφικό υπογοναδισμό. Εκ του in-vitro λειτουργικού ελέγχου των δύο σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου FGFR1 (R254W και R254Q) που μελετήθηκαν, προέκυψε ότι η μέγιστη σηματοδοτική δραστηριότητα για τη μεταλλαγμένη μορφή του υποδοχέα R254W παρουσιάζει μείωση κατά 45% σε σύγκριση με τον wild-type υποδοχέα (p<0.01), ενώ η μέγιστη απάντηση της μεταλλαγμένης μορφής R254Q μειώνεται κατά 15% σε σχέση με το wild-type υποδοχέα, διαφορά που δεν αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική. Ωστόσο και οι δυο μεταλλαγμένες μορφές R254W και R254Q εμφανίζουν ελαττωμένα επίπεδα ολικής έκφρασης (40% και 30% μείωση σε σχέση με τον wild-type, αντίστοιχα), ενώ η πρωτεϊνική ωρίμανση δεν φαίνεται να επηρεάζεται. Τέλος η έκφραση των μεταλλαγμένων μορφών R254W και R254Q επί της κυτταρικής επιφάνειας παρουσιάζεται σημαντικά ελαττωμένη (35%, p<0.01 και 15%, p<0.05, αντιστοίχως). Εκ του μοριακού γονιδιακού ελέγχου που πραγματοποιήθηκε στους ασθενείς με ΕΝΑ βρέθηκε μετάλλαξη του KAL1 σε έναν ασθενή 12 ετών, ο οποίος εμφάνιζε συνοδό ανοσμία, συγκινησία άνω άκρων και κρυψορχία. Στον ασθενή αυτόν τέθηκε η γενετική διάγνωση του ΣΚ και αργότερα υποβλήθηκε σε έγκαιρη έναρξη θεραπευτικής αγωγής. Συμπεράσματα: Το ποσοστό των γνωστών μεταλλάξεων που έχουν εντοπισθεί στους ασθενείς με IGD του Ελλαδικού χώρου είναι πολύ μικρό και επομένως παραμένει πρόσφορο το πεδίο για περαιτέρω έρευνα προς την κατεύθυνση της διευκρίνησης της μοριακής αιτιοπαθογένειας της νόσου. Η σύγκριση φαινότυπου-γονότυπου των ασθενών με σύνδρομο Kallmann υποδεικνύει ότι η παρουσία συνοδού ετερόπλευρης αγενεσίας νεφρού αποτελεί ισχυρή ένδειξη για την ύπαρξη μεταλλαγών στο γονίδιο KAL1. Η ανεύρεση μεταλλάξεων του γονιδίου KAL1 σε παιδιά με ΕΝΑ έχει διττή σημασία· αφενός επιβεβαιώνει την εμπλοκή της ανοσμίνης-1 (του προϊόντος του γονιδίου KAL1) στην οργανογένεση του νεφρού και αφετέρου οδηγεί στην πρώιμη διάγνωση του ΣΚ. Ο μοριακός έλεγχος του γονιδίου KAL1 σε παιδιά με ΕΝΑ συστήνεται επί συνύπαρξης και άλλων κλινικών σημείων του ΣΚ (ανοσμία, κινήσεις καθρέπτη, κρυψορχία, μικροφαλλία) ή ανάδειξης οικογενειακού ιστορικού υπογοναδισμού και ανοσμίας. Ο συγκριτικός λειτουργικός έλεγχος δύο μεταλλάξεων του FGFR1 που επηρεάζουν το ίδιο αμινοξύ (R254W, R254Q) αναδεικνύει την απώλεια της λειτουργικότητας των μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα in-vitro. Αν και από τον in-vitro λειτουργικό έλεγχο προκύπτει ότι η μετάλλαξη R254W είναι πιο σοβαρή από τη μετάλλαξη R254Q, ωστόσο δεν παρατηρείται συσχέτιση του βαθμού της απώλειας της in-vitro λειτουργικότητας των μεταλλαγμένων μορφών του υποδοχέα με τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις. / Background: Isolated GnRH deficiency (IGD) is characterized by a functional deficit of GnRH production or secretion in the hypothalamus resulting in the loss of pulsatile secretion of GnRH and in impaired gonadotropin release, in the setting of otherwise normal anterior pituitary anatomy and function and in the absence of secondary causes of hypogonadotropic hypogonadism (HH). Kallmann syndrome (KS) is characterized by the association of IGD and anosmia, whereas patients with normal olfactory function are referred as having normosmic Idiopathic Hypogonadotropic Hypogonadism (nIHH). Objective: The objective of the study was to describe the different patients phenotypes with IGD (KS and nIHH), to identify mutations in the KAL1, FGFR1, PROK2, PROKR2 and GPR54 genes and to correlate specific phenotypes with the patients genotypes. We also studied the presence of KAL1 mutations in young children with unilateral renal agenesis/dysgenesis, in order to determine the incidence of KAL1 gene mutations in this population. In addition, we attempted to define the in vitro functionality of two FGFR1 mutants (R254W and R254Q), resulting from two different amino acid substitutions of the same residue, and to correlate the in vitro findings to the patients phenotypes. Patients: A total of 66 patients with IGD (26 with KS and 40 with nIHH) were included in this study and mutation analysis of KAL1, FGFR1, PROK2, PROKR2 and GPR54 genes was performed for this group of patients. We also studied 13 children (up to the age of 15) with unilateral renal agenesis/dysgenesis, confirmed by imaging studies. Mutation analysis of KAL1 gene was performed for the later group of patients. Methods: Gene mutation analysis methodology included DNA extraction, polymerase chain reaction amplification, and DNA sequence analysis of all exons of the KAL1, FGFR1, PROK2, PROKR2 and GPR54 genes. The in-vitro functional studies of two FGFR1 mutants (R254W and R254Q) included evaluation of the mutant signaling activity and the expression levels, which were compared to the wild type (WT) receptor signaling activity and expression. Signaling activity was determined by a FGF2/FGFR1dependent transcription reporter assay. Receptor total expression levels were assessed by Western blot assay and receptor cell surface expression was measured by radiolabelled antibody binding assay. Results: We identified 5 different mutations in KAL1 gene in three unrelated male patients with KS (Ε514Κ, Α660Τ, Ε37Κ, T235S, deletion of exons 5-10 of KAL1 gene with STS gene deletion) and one point mutation in FGFR1 gene (R254W) in a male patient with nIHH. The in-vitro functional studies of the two FGFR1 mutants (R254W and R254Q) showed that R254W maximal receptor signaling capacity was reduced by 45% (p<0.01), while maximal signaling of R254Q was also reduced (−15%) but the reduction was not statistically significant relative to WT. However, both mutants displayed diminished total protein expression levels (40% and 30% reduction relative to WT, respectively), while protein maturation was unaffected. Accordingly, cell surface expression levels of the mutant receptors were also significantly reduced (35% p<0.01 and 15% p<0.05, respectively). Sequence analysis of KAL1 gene in the group of patients with unilateral renal agenesis/dysgenesis revealed genetic defects in KAL1 gene in a 12 year old child with associated anosmia, bimanual synkinesis of upper limbs and cryptorchidism. The genetic diagnosis of Kallmann syndrome was established in this case, enabling a prompt therapeutic intervention for puberty induction at a later stage. Conclusions: Up to date very few mutations have been described in patients with IGD in the Greek population and the genetic causes of IGD still remains unclear in the majority of cases, pointing out the importance of further studies for determining the molecular pathogenesis of the disease. The phenotype of renal agenesis/dysgenesis strongly indicates the existence of KAL1 gene defects in the genotype of patients with sporadic KS, providing evidence for the X-linked mode of inheritance and offering the opportunity for genetic counseling. The detection of KAL1 gene mutations in children with unilateral renal agenesis (URA) not only confirms the involvement of anosmin-1 (the product of KAL1 gene) in kidney organogenesis, but it can also lead to an early prepubertal diagnosis of KS. Sequence analysis of KAL1 gene in patients with URA is recommended in those cases with associated clinical signs of KS (e.g. anosmia, mirror movements, cryptorchidism, microphallus) or with familial history of hypogonadism or/and anosmia. The comparative functional analysis of two FGFR1 mutations affecting the same residue (R254W, R254Q) in two unrelated patients with IGD showed that both are loss-of-function mutations and that a tryptophan substitution at R254 (R254W) is more disruptive to receptor structure than the more conserved glutamine substitution (R254Q). However, no clear correlation between the severity of in vitro loss-of-function and phenotypic presentation could be assigned.