Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundärmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachsbestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung: Der Glossy-Phänotyp ist frei von epikutikulären Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von fadenförmigen epikutikulären Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikulärem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgeführt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer täglichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikulären Triterpenen über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans für die katalytische Funktionalität dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden. / Triterpenoids are a large group of secondary metabolites found in different plant species, either as glycoside conjugates or as aglycones. The latter in many cases accumulate to high amounts in the cuticular wax and hence the primary surface of above-ground plant organs, influencing their surface properties. In the present work, the cuticle-specific formation of triterpenoids was investigated in Ricinus communis stems, combining analytical and molecular genetic methods. Two phenotypes of castor bean could be distinguished based on the appearance of the surface of all stem portions including the hypocotyls: The stems of the glossy phenotype are devoid of wax crystals. In contrast, the stems of the glaucous phenotype are covered by a layer of thread-like epicuticular wax crystals. Comparative studies by GC-FID analysis revealed that the cuticles of 67-day old hypocotyls of the glossy and the glaucous phenotypes contained 12.5 and 51.9 µg/cm^2, respectively. The wax mixture of the glossy phenotype was dominated by VLC aliphatic compounds. In the cuticular wax of the glaucous phenotype, VLC aliphatics were found in similar absolute amounts as in the glossy phenotype, whereas the triterpene loads were significantly higher. Here, the wax mixture was dominated by lupeol, making it the single most abundant component (56% of the total wax). To monitor the accumulation of cuticular lupeol during ontogenesis, the chemical composition of the wax mixture was studied at different stages of hypocotyl growth. In these investigations, lupeol was found to accumulate rapidly during early development at the surface of glaucous hypocotyls: between day 6 and day 25 the lupeol load increased by a daily rate of 1.2 µg/cm^2. During the period of highest lupeol increase from day 11 to day 18, a daily rate of 0.013 ng/cell could be calculated. Within that early time period a sharp increase in the number of epicuticular wax crystals on the surface of glaucous hypocotyls was observed by SEM. Based on the cuticular wax analyses of both stem phenotypes, it was hypothesized that a triterpene synthase should exist in castor bean responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol in the glaucous phenotype. In a homology-based cloning approach two epoxysqualene cyclases were cloned from R. communis, functionally expressed in the yeast strain GIL 77 and characterized as a cycloartenol synthase (RcCAS1) and a lupeol synthase (RcLUS1). Both the organ-specific expression of RcLUS1 (with an expression exclusively in stems of the glaucous phenotype) and the expression pattern during hypocotyl development (with a peak at day 12) exactly matched the accumulation of cuticular lupeol in the plant. From the strong correlation of the organ specific and time dependent accumulation of lupeol in the cuticle of glaucous hypocotyls on the one hand, and the expression patterns of the RcLUS1 gene on the other, it can be concluded that the lupeol synthase RcLUS1 from castor bean is the central enzyme responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol. This is the first report on a cuticle-relevant triterpene synthase. Based on the studies on castor bean, it can be concluded that the biosynthesis of cuticular triterpenoids is accomplished by enzymatic cyclisation of the substrate 2,3-oxidosqualene and obviously controlled by a transcription regulation of the corresponding epoxysqualene cyclase. Phylogenetic analyses revealed that RcLUS1 exhibits only weak sequence similarities to the two clades of so far known lupeol synthases and was thus interpreted as a first member of a new class of lupeol synthases in higher plants. The RcLUS1 mutant F257W was created by a site-directed mutagenesis approach and the mutated enzyme was functionally characterized in yeast. The mutation resulted in an altered product pattern, switching from lupeol to β-amyrin, thus confirming the importance of the corresponding Trp in amyrin synthases for the catalytical function of these enzymes. Besides Ricinus communis, Lycopersicon esculentum was chosen as a model plant to study the biosynthesis of cuticular triterpenes. The implementation of the homology-based primer design and cloning strategy developed for castor bean led to the successful cloning of two triterpene synthases from L. esculentum. One of these enzymes, LeTTS1, was characterized as a monofunctional β-amyrin synthase. In contrast to the glaucous stems of R. communis, with α-, β- and δ-amyrin, more then one single triterpene compound accumulates to high amounts in the tomato fruit cuticle. The evidence of the cuticle-relevance of the cloned epoxysqualene cyclases LeTTS1 and LeTTS2 has to be proven in accompanying experiments by determination of the expression patterns of these genes.

Zusammenfassung Hintergrund: In einer vorhergehenden Studie wurde gezeigt, dass die Nitratreduktase (NR, EC 1.6.6.1) aus Blättern von Ricinus communis L. im Vergleich zu NRs der meisten anderen höheren Pflanzen durch verschiedene Faktoren unterschiedlich reguliert wird. Die Aktivität ist ungewöhnlich Mg2+-sensitiv, zeigt ein verändertes pH-Profil und ist nur gering ATP-abhängig inaktivierbar. Das Ziel dieser Arbeit war, die abweichenden Eigenschaften von Ricinus NR, aus molekularer und physiologischer Sicht detaillierter aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde das NR Gen von R. communis geklont, heterolog exprimiert und charakterisiert. Ergebnisse: Die abgeleitete Proteinsequenz zeigte, dass Ricinus NR hohe Ähnlichkeit mit anderem NRs teilte, abgesehen von der N-terminalen Region. In der N-terminalen Region besitzt die Ricinus NR eine säurehaltige Sequenz, die nur in den höheren Pflanzen konserviert ist. In der Moco-bindenden Region waren einige in 17 Pflanzen NRs konservierte Aminosäurepositionen verändert. Zu diesen Positionen gehörten His103, Gln123, Val266 und Ala284, die Asparagin, Arginin, Aspartat und Prolin in den anderen Pflanzen ersetzten. Auch an der Dimerisierungs- und Hinge 1-Region, zeigte die Ricinus NR eine veränderte Aminosäuresequenz. Anstatt Isoleucin und Glycin, besaß die Ricinus NR an den Stellen 460 und 498 Asparagin und Alanin. Durch ein Arg an der Stelle 482 kommt es zu einer zusätzliche Trypsinschnittstelle innerhalb des 481KRHK484-Motivs (die meisten NR besitzen hier KPHK). Zusätzlich enthält die Ricinus NR eine Serinphosphorylierungsstelle (Ser-526) innerhalb des möglichen 14-3-3 Bindemotivs 523KSVS*TP528, was eine allgemeine Eigenschaft von Nitratreduktasen ist. Im C-Terminus von Ricinus NR bestätigte die Sequenz 886CGPPP890, dass die Ricinus NR ein NADH-spezifisches Enzym ist. Die Ricinus NR und Arabidopsis NR2 (AtNR2) wurden in Pichia pastoris funktionell exprimiert und die Eigenschaften miteinander verglichen. Die rekombinante Ricinus NR (RcNR) selbst wurde nicht durch die Inkubation mit MgATP inhibiert, ebenso AtNR2. Da der Hefeextrakt vermutlich die Faktoren zur Regulierung der NR nicht enthält, wurden entsalzte Blattextrakte von Arabidopsis (ADL), Spinat (SDL) und Ricinus (RDL) zugesetzt, die Kinasen und 14-3-3 Proteine enthielten. Damit keine endogenen NRs sich im Extrakt befinden wurden die Blätter vor Extraktion 4 Tage im Dunkeln gehalten. In Bezug auf die Inhibierung der NR durch ATP wurde festgestellt, dass die RcNR gegenüber einer solchen Inhibierung unempfindlich ist, AtNR2 dagegen in jedem Fall durch ATP inaktiviert wird. Bei Kombination von RcNR mit NR-freien Extrakten aus Pflanzen zeigte sich die erhöhte Mg2+-Sensitivität nur, wenn man RcNR mit RDL inkubierte, nicht aber wenn man RcNR mit SDL oder ADL inkubierte. Es liegt auf der Hand, dass ein oder einige Faktoren in RDL vorkommen, die mit RcNR interagieren und seine hohe Mg2+-Sensitivität hervorrufen. Außerdem, ergab eine Inkubation von AtNR2 mit unterschiedlichen NR-freien Blattextrakten eine bedeutende Aktivierung der Enzymaktivitäten, sowohl in Anwesenheit von Mg2+ als auch EDTA. Dies wurde jedoch nicht für die RcNR festgestellt. Nach Verwendung von Ammoniumsulfat zur Fraktionierung des RDL, fand man zusätzlich heraus, dass ungefähr 0,2 mg des Proteins der Fraktion die mit 0-35% Ammoniumsulfat gefällt wurde ausreichten die maximale Hemmung des RcNR hervorzurufen. Schlussfolgerungen: Die Unempfindlichkeit gegenüber ATP erscheint eine angeborene Eigenschaft von Ricinus NR, während die hohe Mg2+-Sensitivität von einem oder einigen Faktoren in den Blättern von Ricinus abhängt. Diese(r) bis jetzt unbekannte Faktor(en) war Hitze-sensitiv und konnte durch Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Er scheint spezifisch auf die rekombinante Ricinus-NR einzuwirken, und liefert eine Mg2+-Sensitivität vergleichbar dem authentischen Blattenzym. Außerdem gibt es vermutlich auch positiv regulierende Faktor(en) für die Nitratreduktase aus Blättern höherer Pflanzen. / Summary Background: In a previous study, nitrate reductase (NR, EC 1.6.6.1) from leaves of Ricinus communis L. showed different regulatory properties from most other higher plants NR's by an unusually strong Mg2+-sensitivity, a different pH-activity profile and only little ATP-dependent inactivation. The aim of this work was to elucidate the deviating properties of Ricinus NR in more details, from both molecular and physiological aspects. For that purpose, the NR gene from R. communis was cloned, expressed heterologously and characterized. Results: The deduced protein sequence showed that Ricinus NR shared high similarity with other NRs, apart from the N-terminal region. In the N-terminal region, the Ricinus NR possesses an acidic stretch which is conserved only in higher plants. Within the Moco-binding domain the Ricinus NR contained few amino acid residues which were unique in comparison with 17 plant NRs, including His103, Gln123, Val266 and Ala284 where other NRs possess asparagine, arginine, aspartate and praline. In the Dimer interface and Hinge 1 regions, the Ricinus NR also had some unique residues like Asn460 and Ala498 where other NRs have isoleucine and glycine instead. The Ricinus NR possesses an Arg482 which provides an additional predicted Trypsin cleavage site within 481KRHK484 (while most of plant-NRs possess KPHK). Additionally, the Ricinus NR contains a serine phosphorylation site (Ser-526) within the potential 14-3-3 binding motif 523KSVS*TP528, which is a common characteristic of nitrate reductases. In the C-Terminus of Ricinus NR a sequence 886CGPPP890 confirmed that Ricinus NR is a NADH-specific enzyme. Functional Ricinus NR protein was expressed in Pichia pastoris and compared with the features of Arabidopsis NR2 synthesized by the same expression system (AtNR2). The recombinant Ricinus NR (RcNR) itself was unresponsive to the incubation with MgATP, and so was AtNR2. As yeast extracts might lack factors required for NR regulation, desalted leaf extracts containing NR kinases and 14-3-3s were prepared from 4-day darkened (and therefore NR-free) leaves of Arabidopsis (ADL), spinach (SDL) and Ricinus (RDL), and added to the assay of RcNR and AtNR2 to check for ATP-dependent inactivation and Mg2+-sensitivity. When RcNR was combined with the NR-free extracts described above, it's unusually high Mg2+-sensitivity was restored only by incubation with RDL, but it remained unresponsive to ATP. In contrast, AtNR2 became inactive when incubated with the protein mixtures and ATP. It is obvious that one or some factors existing in RDL could interact with RcNR and therefore provide its high Mg2+-sensitivity. Interestingly, incubation of AtNR2 with different NR-free leaf extracts gave a significant activation of the enzyme activities, both in Mg2+ and EDTA, which were not observed in the case of RcNR. Moreover, using ammonium sulfate to fractionation the RDL revealed that about 0.2 mg of the protein factor(s) from 0-35% of ammonium sulfate precipitation was sufficient to provide the maximum inhibition of the RcNR. Conclusions: The insensitivity to ATP appears an inherent property of Ricinus NR, whereas the high Mg2+-sensitivity depends on one or several factors in Ricinus leaves. This as yet unknown factor(s) was boiling-sensitive and could be precipitated by ammonium sulfate. It appeared to interact specifically with recombinant Ricinus-NR to provide the Mg2+-sensitivity of the authentic leaf enzyme. Presumably, there is also a positive regulatory factor(s) for nitrate reductase existing in the leaves of higher plants.

Ulm, Univ., Diss., 1999.

Universiẗat, Diss., 2004--Heidelberg.