Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. / Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. / Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.

Os peptídeos hormonais vegetais, que vêm sendo caracterizados em plantas desde a década de 90, podem estar relacionados com defesa, reprodução, crescimento e desenvolvimento de plantas. O peptídeo RALF (Rapid Alkalinization Factor), ubíquo no reino vegetal, está envolvido com o desenvolvimento de plantas. Em arabidopsis há 37 genes que codificam peptídeos RALF (AtRALFs). A isoforma mais estudada é a AtRALF1, a qual regula de maneira negativa a expansão celular, inibindo o crescimento de raiz primária e o alongamento de hipocótilo quando aplicado exogenamente. Recentemente, demonstrou-se a existência de uma relação antagônica entre AtRALF1 e a via de brassinosteróides (BRs) no desenvolvimento de raízes. Quando mutantes da via de sinalização do BR foram avaliados quanto a sua resposta ao peptídeo AtRALF1, descobriu-se que mutantes para o receptor quinase1 associado ao BRI1 (bak1) são insensíveis a AtRALF1. Experimentos utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura, a co-imunoprecipitação e a indução de genes marcadores em mutantes bak1 foram realizados e confirmaram o envolvimento da proteína BAK1 na percepção do peptídeo. Plantas transgênicas que superexpressam AtRALF1 apresentam um fenótipo semi-anão, no entanto, quando as mesmas foram cruzadas com o mutante bak1, suas progênies apresentaram um fenótipo similar ao de plantas selvagens. Ainda, quando plantas deste cruzamento foram novamente cruzadas com plantas selvagens, plantas com fenótipo semi-anão foram observadas na prole. Ensaios de ligação usando o peptídeo AtRALF1 marcado com éster de acridínio foram realizados e mostraram que em mutantes bak1, a ligação do AtRALF1 é menor em aproximadamente 30% quando comparada com plantas selvagens. Os dados obtidos mostram que a proteína BAK1 interage fisicamente com o AtRALF1, está envolvida na percepção do peptídeo, é essencial para a inibição do crescimento da raiz primária causada pelo AtRALF1 e é necessária para a indução dos genes responsivos ao AtRALF1. / The plant peptides, which have been characterized in plants since the 90\'s, can be related to defense, reproduction, growth and development of plants. The RALF (Rapid Alkalinization Factor) peptide, ubiquitous in the plant kingdom, is related to the development of plants. In arabidopsis plants, there are 37 genes encoding RALF peptides (AtRALFs). AtRALF1 is the most studied isoform, which negatively regulate cell expansion, inhibiting primary root growth and hypocotyl elongation when it is applied exogenously. Recently, an antagonistic relationship between AtRALF1 and the brassinosteroids (BRs) to control root development had been demonstrated. When the response of mutants related to the BR signaling pathway to AtRALF1 peptide was investigated, it was found that mutants lacking the BRI1-associated receptor kinase1 (bak1) are insensitive to AtRALF1. Experiments using the two-hybrid system in yeast, co-immunoprecipitation, and the induction of marker genes in bak1 mutants were carried out, and confirmed the involvement of the BAK1 protein in the perception of AtRALF1 peptide. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 are semi-dwarf. However, when those transgenic plants were crossed with bak1 mutant, their progeny showed a wild-type phenotype. Besides, when plants from this progeny were crossed again with wild-type plants, semi-dwarf phenotype plants were obtained in the offspring. Binding assays using AtRALF1 labeled with acridinium-ester were performed, and showed that in bak1 mutants, the AtRALF1 binding was reduced approximately 30% when compared to wild-type plants. All data indicate that BAK1 protein interacts physically with AtRALF1, it\'s involved with the peptide perception, essential for the primary root growth inhibition caused by AtRALF1, and required to the induction of genes responsive to AtRALF1.