Because of shared physiological, anatomical and metabolical features with humans, mice have served for a long time as mammalian disease models. In particular, these last ten years have been the golden age for this favoured model animal. Human and mouse genome projects show that there is 95% genome homology. Spurred by this fact, research attention has shifted from reading these sequences to deciphering the functions of these genes. The 1980s saw the remarkable achievement of homologous recombination in mammalian cell culture systems. Later in the 1990s, innovative gene trapping strategies were developed to enabled random mutagenesis. Today, the goal is to generate more versatile tools to avoid limitations posed by these earlier mutagenesis strategies. Many public and private research centers have united with the aim of mutating all mouse genes. In order to achieve this mutagenesis, the first requirement is a set of practical and efficient viral or plasmid based vectors that can be used globally in the genome. This will be aided by advances in understanding of biological events such as gene transcription, recombination, and embryonic stem cell cycle. In addition, technical improvements such as vector development, precise cell culture assay, and recombinant DNA delivery will also be important. The vector design work in this PhD thesis encompasses 0.00001 % ofthese efforts but may to out to be highly relevant...

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der genetischen Optimierung der Spalthefe S. pombe für die biotechnologische Produktion von Fremdproteinen. Hierbei werden vor allem zwei Aspekte näher untersucht, zum einen die Stabilität des zu produzierenden Proteins und zum anderen die Bildung von Disulfidbrücken. Von anderen Organismen ist bekannt, dass die N-terminale AS im Verbund mit einem Lysinrest ein Protein destabilisieren kann. Das Modellprotein vVEGF besitzt an Position 2 einen Lysinrest (K2) und damit ein Hauptmerkmal eines derartigen Destabilisierungselementes. Falls das Protein dem Ubiquitin-vermittelten Abbau unterliegt, ist es wahrscheinlich, dass K2 eine essenzielle Rolle für die Stabilität dieses Proteins spielt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass K2 in S. cerevisiae destabilisierend wirkt, während es in S. pombe keinen destabilisierenden Effekt hat. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass es Unterschiede im Ubiquitin-vermittelten Abbau von Proteinen in diesen beiden Hefen gibt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Analyse und Optimierung der Bildung von Disulfidbrücken in S. pombe. Disulfidbrücken stellen eines der wichtigsten Elemente der korrekten Proteinfaltung dar und werden in Eukaryonten vorwiegend im oxidierenden Milieu des ER in das naszierende Protein eingeführt. Aus diesem Grunde wurden Proteindisulfid-isomerasen (PDIs) und ER-oxidoreduktin (Ero)-ähnliche Proteine, die die Schlüssel-komponenten der Bildung von Disulfidbrücken in Eukaryonten darstellen, näher untersucht. In S. pombe finden sich insgesamt drei PDI-Homologe (SpPdi1p, SpPdi2p und SpPdi3p) sowie zwei Ero-Homologe (SpEro1a p und SpEro1b p). Mit Ausnahme des nicht glycosylierten SpPdi2p, sind alle Proteine Membran-assoziierte glycosylierte Komponenten des ER. SpPdi2p und SpPdi3p sowie SpEro1a p und SpEro1b p liegen in vivo teilweise in oxidiertem Zustand vor. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass SpEro1b p, nicht jedoch SpEro1a p in der Lage ist, die temperatursensitive S. cerevisiae ero1-1-Mutante funktionell zu komplementieren. Interessanterweise ergab die Untersuchung konservierter Cysteine mittels gerichteter Mutagenese einerseits Unterschiede zwischen SpEro1a p und SpEro1b p sowie andererseits zwischen den S. pombe Ero-Proteinen und den Ero-Proteinen anderer Spezies. Im Gegensatz zu Ero1b p wird Ero1a p durch reduzierenden Stress und Hitzestress induziert. Dies deutet darauf hin, dass SpEro1b p für die Bildung von Disulfidbrücken unter normalen Wachstumsbedingungen nötig ist, während SpEro1a p vornehmlich bei der Adaption der Zellen an Stressbedingungen erforderlich ist. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Expression von SpEro1a p und SpEro1b p zu einer deutlich erhöhten Ausbeute des disulfidhaltigen heterologen Proteins Orf19p-HA führt. Dieser Befund impliziert, dass in S. pombe die Oxidation der Disulfidbrücken für die Faltung von Proteinen vermutlich limitierend ist.

Als "surface-layer" (S-Layer, SL) bezeichnet man die regelmäßig strukturierten Hüllproteinlagen auf der Oberfläche von etwa 80 % aller bisher bekannten Bakterienspezies. Sie entstehen durch Selbstassemblierung von identischen Proteinuntereinheiten, die wiederum zumeist durch nichtkovalente Wechselwirkungen mit der darunterliegenden Zellwandkomponente verknüpft sind. Trotz ihrer Diversität auf der Ebene der Primärstruktur weisen S-Layer verschiedener Bakterienarten einheitliche physikochemische Merkmale auf. Dazu zählt u.a. die Wiedereinnahme einer hochgradig strukturierten, porösen Proteinschicht nach reversibler Denaturierung. Infolge der Reassemblierung entstehen sowohl in Lösung als auch an Phasengrenzen Proteinassemblate, deren Porenanordnungen die gleiche regelmäßige Symmetrie aufweisen, wie die nativen Hüllproteine auf der Bakterienzelle. Das in seiner Domänenstruktur aufgeklärte Hüllprotein SbsC des mesophilen Bakterienstammes Geobacillus (G.) stearothermophilus ATCC 12980 zeichnet sich durch eine ausgezeichnete Synthetisierbarkeit in E. coli aus. C-terminale Fusionen, die im Falle des verstärkt grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) bis zu 240 Aminosäuren umfassen, führten nicht zu einem Verlust der Selbstassemblierung. Darüber hinaus zeigen in vitro gebildete SbsC-Assemblate eine außergewöhnliche Stabilität gegenüber hohen Ethanolkonzentrationen. Die durch gerichtete Mutagenese erzeugten SbsC-Fusionsproteine SbsC(aa 31-1099)-HspA und SbsC(aa 31-1099)-12His besitzen in assemblierter Form im Vergleich mit dem unmodifizierten Protein eine bis zu zweimal höhere Bindungsaffinität gegenüber Platinionen. In denaturierter Form waren beide Fusionsproteine in der Lage, Nickelionen zu komplexieren. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein SL-Protein in einem eukaryontischen Mikroorganismus produziert. Das in der Hefe S. cerevisiae gebildete Fusionsprotein SbsC(aa 31-1099)-EGFP assembliert dabei im Cytosol der Wirtszellen zu röhrenförmigen Assemblaten mit regelmäßiger Symmetrie. Das bisher unbekannte SL-Protein des Stammes G. stearothermophilus DSM 13240 wurde erfolgreich heterolog in E. coli exprimiert. Die Vorläuferform besitzt im Vergleich zum maturen Protein ein 31 aa umfassendes Sekretionssignal am extremen N-Terminus. Sowohl das authentische Protein als auch das heterolog in E. coli exprimierte Vorläuferprotein zeigen eine dem SbsC-Protein vergleichbare Reassemblierungscharakteristik. Im Gegensatz dazu führte die Verkürzung der N-terminalen 30 Aminosäuren des als S13240 bezeichneten Hüllproteins im heterologen System zu einem irreversiblen Verlust der Fähigkeit zur Selbstassemblierung.