Autosomal recessive triple A syndrome is caused by mutations in the AAAS gene encoding the protein ALADIN. The disorder manifests with the triad of adrenocorticotropin-resistant adrenal insufficiency, achalasia of the stomach cardia and impaired tear production (alacrima) in combination with progressive neurological impairment of the central, peripheral and autonomic nervous systems. ALADIN is part of the nuclear pore complex acting as a scaffold nucleoporin. In this work the role of ALADIN in the human adrenocortical tumour cell line NCI-H295R1 was investigated. These cells were engineered to either over-express or down-regulate AAAS by inducible stable transfection. Alterations in steroidogenic gene expression and functional consequences were determined. In addition, the role of ALADIN on cell viability and oxidative stress response was analysed. Using both the human adrenal NCI-H295R1-TR AAAS knock-down and over-expression models the potential impairment of the nuclear import of aprataxin, DNA ligase 1 and ferritin heavy chain 1 was investigated. For this YFP-specific vectors transiently transfected into the cell lines were employed. The findings indicate that AAAS knock-down induces a down-regulation of genes coding for type II microsomal cytochrome P450 hydroxylases CYP17A1 and CYP21A2 and their electron donor enzyme cytochrome P450 oxidoreductase, thereby decreasing biosynthesis of precursor metabolites required for glucocorticoid and androgen production. Furthermore I demonstrate that ALADIN deficiency leads to increased susceptibility to oxidative stress and alteration in redox homeostasis after paraquat treatment. Finally, I show significantly impaired nuclear import of DNA ligase 1, aprataxin and ferritin heavy chain 1 in ALADIN knock-down cells. I conclude that down-regulating ALADIN results in decreased oxidative stress response leading to alteration in steroidogenesis, highlighting the knock-down cell model as an important in vitro tool for studying the adrenal phenotype in triple A syndrome. In an approach to identify new interaction partners of ALADIN, co-immunoprecipitation followed by proteome analyses using mass spectrometry was conducted in a GFP-ALADIN over-expression model using the human adrenocortical tumor cell line NCI-H295R. These results were verified in co-immunoprecipitation assays of endogenous ALADIN using NCI-H295R wild-type cells. The results suggest a possible interaction between ALADIN and microsomal flavoprotein cytochrome P450 oxidoreductase and progesterone receptor membrane compartment 2. Co-localisation analyses of these findings were done using immunofluorescence. The data are suggestive for an involvement of ALADIN in the export of nuclear-encoded mitochondrial proteins. Regulation of adrenocortical steroidogenesis is complex and there is increasing evidence that oxidative stress due to ROS accumulation and mitochondria are significantly involved. Furthermore, there may be an important cross-talk between functional organelles comprising nucleus, ER and mitochondria which presumably involves lipid metabolism. The goal of this work was to elucidate the function of ALADIN for the cellular oxidative stress response and its possible consequences for adrenocortical steroidogenesis in triple A syndrome patients. / Mutationen im AAAS Gen verursachen die autosomal rezessive Krankheit Triple-A-Syndrom. AAAS kodiert das Nukleoporin ALADIN, welches Bestandteil des nukleären Porenkomplexes ist. Phänotypische Charakteristika des Triple-A-Syndroms sind Nebennierenrinden-Insuffizienz, Achalasie des unteren Speiseröhrenschließmuskels und eine fehlende Tränenproduktion (Alakrimie). Diese Symptome sind kombiniert mit progredienten neurologischen Störungen des zentralen, peripheren und autonomen Nervensystems. In dieser Arbeit wurde die Rolle von ALADIN in der humanen Karzinom-Zelllinie NCI-H295R1 untersucht. Diese Nebennierenrinden-Zellen wurden stabil transfiziert und mit einem induzierbaren Expressionssystem modifiziert, so dass sie AAAS entweder überexprimierten oder herunterregulierten. In NCI-H295R1-Zellen wurden Veränderungen der Genexpression von Enzymen der Steroidogenese und funktionelle Konsequenzen der Überexpression oder Herunterregulation von ALADIN gemessen. Des Weiteren wurde die Rolle von ALADIN auf die Zellviabilität und die Redox-Homöostase analysiert. ALADIN überexprimierende und herunterregulierte Zellen wurden verwendet, um die potentielle Behinderung des nukleären Imports von Proteinen zu untersuchen, welche den Zellkern gegen oxidativen Stress schützen (z.B. Aprataxin, DNA-Ligase 1 und Ferritin Heavy Chain 1). Dazu wurden YFP-spezifische Vektoren transient in diese Zellen gebracht. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Herunterregulation von AAAS eine Verminderung der Genexpression von CYP17A1 und CYP21A2 und deren Elektronendonor Cytochrom P450 Oxidoreduktase bewirken. Die Biosynthese der Vorläufermetabolite von Kortisol und Aldosteron ist in diesen Zellen ebenfalls vermindert. Des Weiteren zeigen die ALADIN-defizienten NCIH295R1-Zellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress und eine veränderte Redox-Homöostase nach der Behandlung mit Paraquat. Darüber hinaus konnte in dieser Studie auch gezeigt werden, dass herunterregulierte ALADIN NCI-H295R1-Zellen einen verminderten Zellkernimport von Aprataxin, DNA-Ligase 1 und Ferritin heavy chain 1 besitzen. Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass ALADIN-defiziente Nebennierenzellen eine verminderte Stressantwort auf oxidativen Stress besitzen; dies führt schlussendlich zu einer veränderten Steroidogenese. Das beschriebene ALADIN knock-down Modell in NCI-H295R1-Zellen ist ein wichtiges in vitro Werkzeug, um die Pathogenese der Nebennierenveränderungen im Triple-A-Syndrom zu erforschen. Neue Interaktionspartner von ALADIN wurden mit Hilfe von Co-Immunpräzipitation gefolgt von Proteom-Analysen durch Massenspektrometrie in einem GFP-ALADIN Überexpressionsmodell in NCI-H295R charakterisiert. Die Ergebnisse wurden durch Experimente auf endogenem Niveau in NCI-H295R-Wildtypzellen verifiziert. Mit diesen Daten wird in dieser Arbeit erstmals eine Interaktion zwischen ALADIN und dem Flavoprotein Cytochrom P450 Oxidoreduktase und Progesterone Receptor Membrane Compartment 2 nachgewiesen. Diese Ergebnisse wurden mit Co-Lokalisierungsanalysen durch Immunfluoreszenzfärbung von ALADIN und Cytochrome P450 Oxidoreduktase ergänzt. Außerdem gibt die Arbeit Hinweise darauf, dass ALADIN als Nukleoporin an dem nuklearen Export mitochondrialer Vorläuferproteine beteiligt ist. Die Regulation der Steroidogenese in der Nebennierenrinde ist komplex und es existieren zahlreiche Hinweise darauf, dass oxidativer Stress aufgrund der Ansammlung reaktiver Sauerstoffradikale und. dass die Mitochondrien involviert sind. Außerdem ist ein funktionelles Zusammenspiel verschiedener Organellen, darunter Nukleus, ER und Mitochondrien, von großer Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Funktion von ALADIN in der zellulären oxidativen Stressantwort und die möglichen Konsequenzen für die Steroidogenese in der Nebennierenrinden in Triple-A-Syndrom-Patienten.