Memoria para optar al Título de Químico Farmacéutico / El quillay, Quillaja saponaria Mol., Quillajaceae, es un árbol de la zona central de Chile usado desde tiempos precolombinos como detergente. Sus saponinas crudas se utilizan como agentes espumantes y emulsificantes; y en forma más purificada, para la preparación de vacunas y otros productos medicinales. Las saponinas del quillay han sido caracterizadas como una mezcla compleja de glicósidos y ésteres azucarados de ácido quillaico; y ocasionalmente, de ácido equinocístico, 22β- hidroxi-quillaico o fitolacagénico. En el presente trabajo, se utilizó un extracto acuoso de corteza de quillay el cual se hidrolizó con HCl al 18% y calentamiento a reflujo para obtener un producto de hidrólisis al que se le purificó mediante sucesivas columnas cromatográficas de sílica gel G y Sephadex® LH-20. Se aislaron 6 sapogeninas triterpénicas denominadas Qy1, Qy2, Qy3, Qy4, Qy5 y Qy6. Qy1 fue identificada como ácido quillaico, Qy5 como ácido fitolacagénico, mientras que Qy6 se caracterizó como el isómero olean-13(18)-eno del ácido quillaico, un artefacto formado a partir de Qy1 en medio ácido. El resto de las sapogeninas, en tanto, aún no han sido completamente identificadas. La caracterización de los compuestos se realizó mediante espectrometría de masas y espectroscopía de resonancia magnética nuclear unidimensional y bidimensional. En el caso de la valoración por HPLC, el ácido quillaico demostró ser la sapogenina mayoritaria dentro del extracto acuoso (68,9% dentro del producto de hidrólisis, mientras que ácido fitolacagénico estuvo presente en un 5,0%). En el ensayo de inhibición de la glicógeno fosforilasa a (GPa), una enzima implicada en la biosíntesis de glucosa cuya actividad se incrementa en la diabetes; fueron evaluados Qy1, Qy3, Qy5, Qy6 y el producto de hidrólisis. Los resultados demostraron que todos los compuestos fueron menos potentes que la cafeína, el compuesto de referencia. Sin embargo, Qy3 demostró ser el único triterpenoide más eficaz que la cafeína (81,5% versus 68,4%), indicando que al menos una sapogenina de la corteza de quillay presentó una significativa actividad inhibitoria de la GPa. Es importante recalcar que si bien Qy3 fue el compuesto más activo, tanto en potencia como en eficacia, el producto de hidrólisis presentó una potencia casi nula y una eficacia de 16,8%. Estos resultados podrían ser explicados por el hecho de que Qy3 se encontró en baja concentración dentro de éste, o bien, otros constituyentes del producto de hidrólisis pudieron tener efectos antagonistas. En síntesis, esta memoria contribuyó a ampliar el conocimiento de la composición química de este árbol autóctono y se pudo evaluar su efecto sobre la GPa, demostrando que Qy3 es el triterpenoide más eficaz / Quillay, Quillaja saponaria Mol., Quillajaceae, is a chilean central zone tree, used since precolumbian times as a detergent agent. Its raw saponins are employed as foaming and emulsifiers agents; and most purified form, in the elaboration of vaccines and other medicinal products. Quillay saponins have been characterized as a complex mixture of quillaic acid with glycosides and esters, and occasionally, of echynocystic acid, 22β- hydroxy-quillaic acid or phytolaccagenic acid. In the present work, an aqueous quillay bark extract was hydrolyzed with HCl 18% and warmed to reflux in order to get a hydrolysis product, which was later purified consecutively into G silica gel and Sephadex® LH-20 columns. Six triterpenic sapogenins were isolated, called Qy1, Qy2, Qy3, Qy4, Qy5 and Qy6. Qy1 was identified as quillaic acid, Qy5 as phytolaccagenic acid, while Qy6 was characterized as the olean-13(18)-en isomer of quillaic acid, an artifact formed from Qy1 in acid media. Other sapogenins haven’t been completely identified yet. The structural characterization of compounds was made by mass spectrometry and mono and bidimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. In the case of HPLC quantification, quillaic acid demonstrated to be the most abundant sapogenin obtained from the aqueous extract (68,9% on the hydrolysis product, while phytolaccagenic acid was present in a 5,0%). In the glycogen phosphorylase a (GPa) inhibition assay, an enzyme involved in the glucose biosynthesis which shows an increased activity in diabetes; Qy1, Qy3, Qy5, Qy6 and the hydrolysis product were evaluated. The results demonstrated that all the compounds were much less potent than caffeine, the reference compound. However, Qy3 was as far as the only triterpenoid more efficacious than caffeine (81,5% versus 68,4%). These issues indicated that at least one quillay cortex sapogenin performed a significative GPa inhibitory activity. It’s important to remark that although Qy3 was the most active compound in potency and efficacy, the hydrolysis product showed almost null potency and efficacy near to 16,8%. These results could be explained by the fact that Qy3 was in low concentration, or other constituents of the hydrolysis product could have an antagonist effects. In summary, this thesis contributed to increase the knowledge of the chemical composition of this autochthon tree and its effect on GPa could be evaluated, demonstrating that Qy3 was the most efficacious triterpenoid

Memoria para optar al Título de Químico Farmacéutico / El quillay, Quillaja saponaria Mol., perteneciente a la familia Quillajaceae, es un árbol que crece en gran parte de la zona central de Chile tanto en el litoral como en el valle. Este árbol sido usado desde la época precolombina como detergente, debido a su gran cantidad de saponinas. El producto de hidrólisis del extracto acuoso obtenido de la biomasa de quillay, es rico en sapogeninas. Estudios anteriores han reportado la presencia de algunas geninas tales como ácido quillaico, ácido fitolagénico, ácido equinocístico y gipsogenina entre otras. Las sapogeninas triterpénicas pentacíclicas han demostrado tener efecto inhibitorio sobre la enzima glicógeno fosforilasa a. Para el presente trabajo se sometió a hidrólisis el extracto acuoso obtenido desde la biomasa de quillay con HCl al 18 % y calentamiento a reflujo. El producto de hidrólisis obtenido se lavó sucesivamente con dos porciones de 10 ml de NaOH 0,05 M para eliminar las trazas de compuestos fenólicos que pudiesen quedar en el producto de hidrólisis. Éste fue fraccionado mediante sucesivas columnas cromatográficas con relleno sílica gel 60, de las cuales se obtuvo 5 grupos de fracciones denominadas Pol-1, Pol-2, Pol-3, Pol-4, Pol-5. Los 5 grupos de fracciones obtenidos y el producto de hidrólisis fueron evaluados mediante el ensayo de inhibición de la enzima glicógeno fosforilasa a. Los porcentajes de inhibición obtenidos demuestran que estos grupos de fracciones no inhiben la enzima glicógeno fosforilasa a. La identificación de las geninas minoritarias del producto de hidrólisis, se realizó mediante la metodología CLAE-UV-IES-MS. Los resultados nos permiten postular la presencia de ácido quillaico y otras sapogeninas no reportadas anteriormente, como es el caso de la arjungenina y la fitolacagenina. Para estas tres sapogeninas identificadas se propuso una ruta de fragmentación, la cual al contener puntos comunes para estos núcleos triterpénicos, serían una herramienta útil en la identificación de otras sapogeninas triterpénicas pentacíclicas

Orientador: Alba Regina Monteiro Souza Brito / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T10:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dunder_RicardoJose_M.pdf: 1595307 bytes, checksum: 5bbe63a096df01d64237468f549cd829 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A dor é definida como uma sensação complexa e indefinida envolvendo múltiplos fatores como estilo de vida, ambiente. Muitas vezes a dor é produto de um processo inflamatório. As inflamações são uma resposta do sistema imune a diferentes estímulos, microorganismos, danos teciduais, estímulos miogênicos ou até traumas cirúrgicos que liberam mediadores endógenos. Ao receber o estímulo, diferentes enzimas como fosfolipases e ciclooxigenases originam mediadores inflamatórios (prostaglandinas, citocinas, leucotrienos) dando continuidade à cascata inflamatória muitas vezes de maneira exacerbada, que é caracterizada pelos cinco sinais cardinais da inflamação: calor, rubor, tumor, dor e perda de função. Para o tratamento das inflamações as drogas de primeira escolha são os antiinflamatórios não esteroidais (DAINES), que atuam na inibição da ciclooxigenase (COX-2), contudo, o uso das DAINES pode provocar o advento de úlceras pépticas, ou até mesmo falência renal e problemas cardíacos no caso dos inibidores seletivos da COX. Em inflamações crônicas utilizam-se os Glicocorticóides (GC), que são potentes antiinflamatórios, mas provocam efeitos colaterais sistêmicos como hipoglicemia, ação no sistema nervoso central e uma deficiência no sistema imune. A utilização de princípios ativos vegetais é uma alternativa para o controle das inflamações, entre elas destacam-se plantas da família Agavaceae, principalmente do gênero Agave, com destaque para Agave sisalana rica em saponinas esteroidais. As saponinas são uma classe de metabólitos secundários que apresentam diferentes funções terapêuticas, de grande interesse comercial e farmacológico. Esses compostos apresentam um núcleo esteroidal envolto por cadeias de açúcares denominado aglicona ou sapogenina. A partir das folhas da Agave sisalana obteve-se a fração hexânica de Agave sisalana (FHAS), que teve seu potencial terapêutico avaliado em diferentes testes de inflamação, algesia e toxicidade. A FHAS apresentou uma redução significativa (p<0,05) edema nos modelos agudos de inflamação; edema de orelha por Xilol e edema de pata induzido por carragenina. A FHAS também apresentou diminuições significativas no modelo crônico de inflamação Granuloma cotton pellet, que avalia a infiltração celular. Os valores obtidos no cotton pellet foram corroborados pelo modelo de pleurisia, em que também houve redução do infiltrado celular. A FHAS demonstrou um potencial antinociceptivo nos modelos de analgesia, porém com uma ação bem menor do que os fármacos padrão, o que indica que o mecanismo de ação parece não envolver atuação com receptores opióides em modelos de analgesia. Com relação à toxicidade a FHAS não apresentou aumento significativo (p<0,05) de proteínas plasmáticas. Na avaliação do peso animais nenhuma das doses da FHAS apresentou efeito significativo sobre a evolução ponderal de peso dos animais, como foi o caso do controle positivo GC, o que indica ausência de efeitos colaterais graves, semelhantes aos GC. Através da análise dos dados, indicam que ação antiinflamatória e analgésica encontrada deve-se a presença das sapogeninas esteroidais na FHAS, principalmente a hecogenina. Devido a esses resultados, novas avaliações serão feitas para elucidar o mecanismo de ação antiinflamatório apresenta ação semelhante aos GC, trazendo assim perspectivas de uso medicinal da Agave sisalana. / Abstract: Pain is defined as complex and vague sensation that involves several factors such as life style and environment. Many times pain is a result of an inflammatory process. The inflammation an imune system response to different kind of stimulus, microorganisms, tissue injuries, miogenic stimulus or even cirurgic traumas, which release several endogens mediators. Receiving the stimulus, diferents enzymes as phospholipase and ciclogenasis, lead to inflammatory mediators (prostaglandins, citocins and leukotrienes) which continuity the inflammatory cascade, many times in an exarcebate manner, described by the five cardinals signs: Heat, redness, swelling, pain and loss of function. Inflammation Treatment the first choice in medicine are non steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDS) that acts in inhibition of COX-2. However, the use of NSAIDS can bring peptic ulcers or kidney failure and cardiac problems in selective COX inhibitors. Chronic inflammation uses Glucocorticoids therapy that are powerfull drugs, but they provoque systemics side effects: as hypoglicemy, nervous system activity and immune system depression. The use of active compounds present in plants is a way to inflammatory controll, among them there are plants of Agavaceae family mainly Agave genus, such as Agave sisalana which is rich in steroidals saponins. Saponins are a secundary metabolic class that present several therapeutic functions, with a large comercial and pharmacological interest. These compounds present steroidal nucleus involved by sugar chains called algycone or sapogenins. From the Agave sisalana was taken Agave sisalana hexanic fraction (FHAS) that had its therapeutic potential evaluated in differents inflammatory, algesic and toxicity tests. FHAS showed significative responses for acute inflammatory models with antiedematogenic activity as xylene ear edema and carrageenan hind paw edema. FHAS also presents significative results chronic models like granuloma cotton pellet, which evaluate cell infiltration. The values gotten on cotton pellet were confirmed with pleurisy model, where there were reduction of cellular infiltrate. FHAS showed antinociceptive potential in algesic tests, with a smaller action than standard medicine, which indicates that the action mechanisms does not acts on opioid receptors in analgesic models. In connection to toxicity, FHAS does not present increase of plasmatics proteins, and animal weight evaluation none of FHAS doses showed significative effects considering weight up of animals. In case of positive control GC that indicates absence of side effects such GC. Throughout data analyses, the antiinflammatory and analgesic action founded is tempted by sapogenins presence on FHAS. These results need new evaluation to explain the antiinflammatory action mechanisms bringing new perspectives of Agave sisalana medical use. / Mestrado / Mestre em Biologia Funcional e Molecular