A formação de micorrizas arbusculares é um processo regulado geneticamente e envolve alterações da expressão gênica da planta e do fungo. Poucos genes essenciais para o desenvolvimento da simbiose foram identificados até o presente. Para identificar genes possivelmente envolvidos no controle da colonização fúngica intrarradicular, o perfil de seqüências expressas em raízes de cana-de-açúcar colonizadas por Glomus clarum, em condições de baixo e alto fósforo (P), foi avaliado através do seqüenciamento em larga escala de ESTs e hibridização em macroarranjos de cDNAs. Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar foram plantadas em vasos contendo substrato composto por areia:vermiculita (3:1, vol/vol) e adubado com 20 ou 200 mg P kg-1 de substrato e inoculadas com Glomus clarum. A biomassa seca da parte aérea e a taxa de colonização micorrízica das raízes foram avaliadas no momento da colheita que foi feita oito ou doze semanas após o plantio. O RNA poliA foi extraído das raízes e utilizado para a síntese de cDNAs. Neste trabalho, quatro bibliotecas de cDNA e uma biblioteca subtrativa supressiva foram preparadas a partir de cDNAs de raízes de cana-de-açúcar colonizadas por G. clarum. Esta abordagem resultou na identificação de 1,925 ESTs as quais foram agrupadas em 1615 genes supostamente regulados pela micorrização. Estes clones foram analisados por Northern blots eletrônico, e aqueles que foram diferencialmente expressos foram submetidos a hibridização em macroarranjos de cDNAs. Um total de 386 genes foram arranjados em membranas de náilon e sua expressão avaliada por sondas sintetizadas a partir de cDNA extraído de raízes em diferentes condições. Dentre os genes com expressão diferencial significativa estatística em raízes colonizadas por G. clarum, em condições de baixo e alto P, foram detectados genes codificando proteínas putativamente envolvidas na percepção de moléculas sinais (receptor tipo quinase de proteína), transporte de íons (canais de íons), transdução de sinais (quinases de proteína e calmodulina), regulação da transcrição (fatores de transcrição), alterações de parede celular e citoesqueleto (extensina, arabinogalactanas, tubulinas), respostas de defesa e estresse (síntese de fitoalexinas e metalotioneínas), síntese de fitohormônios (nitrilase). Os dados sugerem que a transdução de sinais em MAs se dá através da fosforilação de proteínas e que a indução de respostas anti-oxidantes pode ser importante para o desenvolvimento da simbiose. Da mesma forma, os dados sugerem que a atividade de aspartatoproteases podem ser essenciais para o controle do crescimento fúngico intrarradicular. A caracterização desses genes e seus padrões de expressão em MAs poderá elucidar os mecanismos genéticos envolvidos no controle da simbiose. / The formation of arbuscular mycorrhizae (AM) is a genetically regulated process and involves alteration in both plant and fungus gene expression. Few genes essential for the development of the symbioses have been identified so far. In order to identify genes possible involved in the intraradical fungal colonization control, the profiles of expressed sequences in sugarcane roots colonized roots with Glomus clarum at low or high phosphate (P) conditions were evaluated using large scale EST sequencing and cDNA macroarray hybridization. Sugarcane micropropagated seedlings were planted in pots containing sand:vermiculite (3:1, vol:vol), and fertilized with 20 or 200 mg P kg-1 substrate. Seedlings were inoculated with G. clarum and cultivated under greenhouse conditions for 8 or 12 weeks. After harvesting shoot dry weight and root colonization rates were evaluated. PolyA RNA was extracted from the root tissues and used for cDNA synthesis. In this work, one suppressive subtractive library and four cDNA libraries were synthesized using cDNA from sugarcane roots not-colonized or colonized by G. clarum, at low and high P conditions. This approach resulted in the identification of 1,925 ESTs which were clustered in 1,615 genes. The expression of these genes was evaluated using electronic Northern blots. A total of 386 genes with putative differential expression were spotted into nylon membranes in macroarrays and their expression profiles in roots under different conditions were evaluated using macroarray hybridization. Among the genes with statistically significant differential expression, in roots colonized by G. clarum grown at low or high P conditions, it was detected genes encoding proteins putatively involved in the perception of signal molecules (receptor-like protein kinase), ion transporte (channel-like protein precursor), signal transduction (protein kinases and calmodulin), transcriptional regulation (transcription factor), cell wall and cytoskeleton alterations (extensin, arabinogalactans, and tubulins), defense and stress responses (phythoalexins synthesis and metalothioneins), and phytohormone biosynthesis (nitrilases). Our data suggest that the signal transduction in AM occurs through protein phosphorylation, and that the induction of anti-oxidant responses may be important for the development of the symbioses. Additionally, the data suggest that aspartic-proteases might be essential for the control of intraradical fungal growth. Further characterization of these genes and their expression patterns in AM would contribute to elucidate the genetic mechanisms controlling the symbioses.

A formação de micorrizas arbusculares é um processo regulado geneticamente e envolve alterações da expressão gênica da planta e do fungo. Poucos genes essenciais para o desenvolvimento da simbiose foram identificados até o presente. Para identificar genes possivelmente envolvidos no controle da colonização fúngica intrarradicular, o perfil de seqüências expressas em raízes de cana-de-açúcar colonizadas por Glomus clarum, em condições de baixo e alto fósforo (P), foi avaliado através do seqüenciamento em larga escala de ESTs e hibridização em macroarranjos de cDNAs. Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar foram plantadas em vasos contendo substrato composto por areia:vermiculita (3:1, vol/vol) e adubado com 20 ou 200 mg P kg-1 de substrato e inoculadas com Glomus clarum. A biomassa seca da parte aérea e a taxa de colonização micorrízica das raízes foram avaliadas no momento da colheita que foi feita oito ou doze semanas após o plantio. O RNA poliA foi extraído das raízes e utilizado para a síntese de cDNAs. Neste trabalho, quatro bibliotecas de cDNA e uma biblioteca subtrativa supressiva foram preparadas a partir de cDNAs de raízes de cana-de-açúcar colonizadas por G. clarum. Esta abordagem resultou na identificação de 1,925 ESTs as quais foram agrupadas em 1615 genes supostamente regulados pela micorrização. Estes clones foram analisados por Northern blots eletrônico, e aqueles que foram diferencialmente expressos foram submetidos a hibridização em macroarranjos de cDNAs. Um total de 386 genes foram arranjados em membranas de náilon e sua expressão avaliada por sondas sintetizadas a partir de cDNA extraído de raízes em diferentes condições. Dentre os genes com expressão diferencial significativa estatística em raízes colonizadas por G. clarum, em condições de baixo e alto P, foram detectados genes codificando proteínas putativamente envolvidas na percepção de moléculas sinais (receptor tipo quinase de proteína), transporte de íons (canais de íons), transdução de sinais (quinases de proteína e calmodulina), regulação da transcrição (fatores de transcrição), alterações de parede celular e citoesqueleto (extensina, arabinogalactanas, tubulinas), respostas de defesa e estresse (síntese de fitoalexinas e metalotioneínas), síntese de fitohormônios (nitrilase). Os dados sugerem que a transdução de sinais em MAs se dá através da fosforilação de proteínas e que a indução de respostas anti-oxidantes pode ser importante para o desenvolvimento da simbiose. Da mesma forma, os dados sugerem que a atividade de aspartatoproteases podem ser essenciais para o controle do crescimento fúngico intrarradicular. A caracterização desses genes e seus padrões de expressão em MAs poderá elucidar os mecanismos genéticos envolvidos no controle da simbiose. / The formation of arbuscular mycorrhizae (AM) is a genetically regulated process and involves alteration in both plant and fungus gene expression. Few genes essential for the development of the symbioses have been identified so far. In order to identify genes possible involved in the intraradical fungal colonization control, the profiles of expressed sequences in sugarcane roots colonized roots with Glomus clarum at low or high phosphate (P) conditions were evaluated using large scale EST sequencing and cDNA macroarray hybridization. Sugarcane micropropagated seedlings were planted in pots containing sand:vermiculite (3:1, vol:vol), and fertilized with 20 or 200 mg P kg-1 substrate. Seedlings were inoculated with G. clarum and cultivated under greenhouse conditions for 8 or 12 weeks. After harvesting shoot dry weight and root colonization rates were evaluated. PolyA RNA was extracted from the root tissues and used for cDNA synthesis. In this work, one suppressive subtractive library and four cDNA libraries were synthesized using cDNA from sugarcane roots not-colonized or colonized by G. clarum, at low and high P conditions. This approach resulted in the identification of 1,925 ESTs which were clustered in 1,615 genes. The expression of these genes was evaluated using electronic Northern blots. A total of 386 genes with putative differential expression were spotted into nylon membranes in macroarrays and their expression profiles in roots under different conditions were evaluated using macroarray hybridization. Among the genes with statistically significant differential expression, in roots colonized by G. clarum grown at low or high P conditions, it was detected genes encoding proteins putatively involved in the perception of signal molecules (receptor-like protein kinase), ion transporte (channel-like protein precursor), signal transduction (protein kinases and calmodulin), transcriptional regulation (transcription factor), cell wall and cytoskeleton alterations (extensin, arabinogalactans, and tubulins), defense and stress responses (phythoalexins synthesis and metalothioneins), and phytohormone biosynthesis (nitrilases). Our data suggest that the signal transduction in AM occurs through protein phosphorylation, and that the induction of anti-oxidant responses may be important for the development of the symbioses. Additionally, the data suggest that aspartic-proteases might be essential for the control of intraradical fungal growth. Further characterization of these genes and their expression patterns in AM would contribute to elucidate the genetic mechanisms controlling the symbioses.

O grupo de organoclorados, Bifenilas Policloradas (PCBs) é de difícil degradação e persistente no meio ambiente, tendo sido associado a diversos problemas nos organismos devido ao potencial toxicológico. Biodegradação constitui uma ferramenta eficaz e barata para remoção destes contaminantes do ambiente. O isolado RHA1 (fcb) de Rhodococcus sp. foi geneticamente construído com a introdução do operon de degradação hidrolítica de 4-clorobenzoato (fcb) para evitar a formação de produtos tóxicos durante a degradação de ácidos clorobenzóicos. Com o intuito de se obter informações sobre o processo adaptativo do recombinante Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) em substratos contendo PCBs, foram feitos dois ensaios avaliando-se a sobrevivência e o crescimento deste isolado. Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) foi inoculado (104 células.g-1) em substrato turfoso previamente irradiado a 50 KGy, contendo ou não 200 mg.Kg-1 de bifenilo. Em outro ensaio, além do recombinante, as bactérias Escherichia coli e Arthrobacter sp. foram inoculados em sedimento coletado na região do Estuário de Santos, contendo PHAs e PCBs, também irradiado (50 KGy). O crescimento das bactérias em ambos os substratos foi monitorado através de contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Algumas colônias eram selecionadas aleatoriamente para extração de DNA, detecção do operon fcb através de amplificação por PCR e sequenciamento do gene 16S rRNA. Aumento no número de UFCs nos tratamentos inoculados com o recombinante foi observado até 150 dias no ensaio com substrato turfoso e 70 dias na amostra ambiental. Entretanto, houve queda no número de UFCs após os 10 dias nos tratamentos inoculados com E. coli e Arthrobacter sp. Os genes fcbA e fcbB do operon fcb foram detectados nas colônias isoladas dos tratamentos inoculados com o isolado RHA1 (fcb) em ambos os substratos. A análise das seqüências pertencentes às colônias isoladas do tratamento inoculado com o isolado RHA1 (fcb) feita através de BLAST nos sites do NCBI e Ribossomal Database Project, apresentou 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de Rhodococcus sp. isolado ZC–3 (AM076672.1). Somente as seqüências referentes ao tratamento inoculado com E. coli foram analisadas, as quais apresentaram 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de E. coli isolado K-12 MG 1655 (U00096.2). Estes resultados sugerem que Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) cresce na turfa irradiada (até 150 dias) na presença e ausência de PCB e nesta amostra de sedimento irradiada (até 70 dias), com aparente estabilidade do operon fcb durante este período e nestas condições. A possível presença dos genes fcbB e fcbA em bactérias nativas crescidas em meio K1 com ácido 4- clorobenzóico isoladas do sedimento antes da irradiação, sugere a presença de bactérias do local com potencial biodegradador deste composto. / The group of organochlorates Biphenyl Polychlorates (PCBs) is of difficult degradation and persistent in the environment, being associated to several problems in the organisms due to its toxicological potential. The isolate RHA1 (fcb) from Rhodococcus sp. was genetically built with the introduction of the operon of hydrolytic degradation 4-chlorobenzoate (fcb) to avoid the formation of toxic products during the degradation of chlorobenzoic acids. In order to obtain information about the adaptative process of the recombinant Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) in substrates containing PCBs, two essays were made evaluating the survival and growth of this isolate. Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) was inoculated (104 cells.g-1) in peat substrate previously irradiated with 50 kGy, with and without 200 mg.kg-1 of biphenyl. In another essay, besides of the recombinant, the bacteria Escherichia coli and Arthrobacter sp. were inoculated in soil, also irradiated (50 kGy), from the Estuário de Santos region containing PHAs and PCBs. The growth of the bacteria in both substrates was monitorated counting the Colony Forming Units (CFUs). Some colonies were selected randomly for DNA extraction, fcb operon detection through PCR, and sequencing of the 16S rRNA gene. Rising in the number of CFUs in the recombinant inoculated treatments was observed until 150 days in the essay with peat substrate, and until 70 days in the environmental sample. Nonetheless, there was a reduction in the number of CFUs after 10 days in the treatment inoculated with E. coli and Arthrobacter sp. The genes fcbA and fcbB from the operon fcb were detected in the isolated colonies of the treatments inoculated with the isolate RHA1 (fcb) in both substrates. The analysis of the sequences belonging to the colonies isolated from the treatment inoculated with the isolate RHA1 (fcb) through BLAST in the NCBI and Ribosomal Database Project sites showed 99% identity with the sequence of the gene 16S ribosomal from Rhodococcus sp. isolate ZC-3 (AM076672.1). Only the sequences referring to the treatment inoculated with E. coli were analyzed, which showed 99% identity with the sequence of the 16S ribosomal gene from E. coli isolate K-12 MG 1655 (U00096.2). These results suggest that Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) grows in the peat irradiated (until 150 days), in the presence and absence of PCB and in this irradiated sediment sample (until 70 days), with apparent stability of the fcb operon during this period and in these conditions. The possible presence of the fcbA and fcbB genes in native bacteria grown in K1 medium with 4-chlorobenzoate acid isolated from sediment before irradiation suggests the presence of native bacteria with biodegradation potential of this compound.

O grupo de organoclorados, Bifenilas Policloradas (PCBs) é de difícil degradação e persistente no meio ambiente, tendo sido associado a diversos problemas nos organismos devido ao potencial toxicológico. Biodegradação constitui uma ferramenta eficaz e barata para remoção destes contaminantes do ambiente. O isolado RHA1 (fcb) de Rhodococcus sp. foi geneticamente construído com a introdução do operon de degradação hidrolítica de 4-clorobenzoato (fcb) para evitar a formação de produtos tóxicos durante a degradação de ácidos clorobenzóicos. Com o intuito de se obter informações sobre o processo adaptativo do recombinante Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) em substratos contendo PCBs, foram feitos dois ensaios avaliando-se a sobrevivência e o crescimento deste isolado. Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) foi inoculado (104 células.g-1) em substrato turfoso previamente irradiado a 50 KGy, contendo ou não 200 mg.Kg-1 de bifenilo. Em outro ensaio, além do recombinante, as bactérias Escherichia coli e Arthrobacter sp. foram inoculados em sedimento coletado na região do Estuário de Santos, contendo PHAs e PCBs, também irradiado (50 KGy). O crescimento das bactérias em ambos os substratos foi monitorado através de contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Algumas colônias eram selecionadas aleatoriamente para extração de DNA, detecção do operon fcb através de amplificação por PCR e sequenciamento do gene 16S rRNA. Aumento no número de UFCs nos tratamentos inoculados com o recombinante foi observado até 150 dias no ensaio com substrato turfoso e 70 dias na amostra ambiental. Entretanto, houve queda no número de UFCs após os 10 dias nos tratamentos inoculados com E. coli e Arthrobacter sp. Os genes fcbA e fcbB do operon fcb foram detectados nas colônias isoladas dos tratamentos inoculados com o isolado RHA1 (fcb) em ambos os substratos. A análise das seqüências pertencentes às colônias isoladas do tratamento inoculado com o isolado RHA1 (fcb) feita através de BLAST nos sites do NCBI e Ribossomal Database Project, apresentou 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de Rhodococcus sp. isolado ZC–3 (AM076672.1). Somente as seqüências referentes ao tratamento inoculado com E. coli foram analisadas, as quais apresentaram 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de E. coli isolado K-12 MG 1655 (U00096.2). Estes resultados sugerem que Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) cresce na turfa irradiada (até 150 dias) na presença e ausência de PCB e nesta amostra de sedimento irradiada (até 70 dias), com aparente estabilidade do operon fcb durante este período e nestas condições. A possível presença dos genes fcbB e fcbA em bactérias nativas crescidas em meio K1 com ácido 4- clorobenzóico isoladas do sedimento antes da irradiação, sugere a presença de bactérias do local com potencial biodegradador deste composto. / The group of organochlorates Biphenyl Polychlorates (PCBs) is of difficult degradation and persistent in the environment, being associated to several problems in the organisms due to its toxicological potential. The isolate RHA1 (fcb) from Rhodococcus sp. was genetically built with the introduction of the operon of hydrolytic degradation 4-chlorobenzoate (fcb) to avoid the formation of toxic products during the degradation of chlorobenzoic acids. In order to obtain information about the adaptative process of the recombinant Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) in substrates containing PCBs, two essays were made evaluating the survival and growth of this isolate. Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) was inoculated (104 cells.g-1) in peat substrate previously irradiated with 50 kGy, with and without 200 mg.kg-1 of biphenyl. In another essay, besides of the recombinant, the bacteria Escherichia coli and Arthrobacter sp. were inoculated in soil, also irradiated (50 kGy), from the Estuário de Santos region containing PHAs and PCBs. The growth of the bacteria in both substrates was monitorated counting the Colony Forming Units (CFUs). Some colonies were selected randomly for DNA extraction, fcb operon detection through PCR, and sequencing of the 16S rRNA gene. Rising in the number of CFUs in the recombinant inoculated treatments was observed until 150 days in the essay with peat substrate, and until 70 days in the environmental sample. Nonetheless, there was a reduction in the number of CFUs after 10 days in the treatment inoculated with E. coli and Arthrobacter sp. The genes fcbA and fcbB from the operon fcb were detected in the isolated colonies of the treatments inoculated with the isolate RHA1 (fcb) in both substrates. The analysis of the sequences belonging to the colonies isolated from the treatment inoculated with the isolate RHA1 (fcb) through BLAST in the NCBI and Ribosomal Database Project sites showed 99% identity with the sequence of the gene 16S ribosomal from Rhodococcus sp. isolate ZC-3 (AM076672.1). Only the sequences referring to the treatment inoculated with E. coli were analyzed, which showed 99% identity with the sequence of the 16S ribosomal gene from E. coli isolate K-12 MG 1655 (U00096.2). These results suggest that Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) grows in the peat irradiated (until 150 days), in the presence and absence of PCB and in this irradiated sediment sample (until 70 days), with apparent stability of the fcb operon during this period and in these conditions. The possible presence of the fcbA and fcbB genes in native bacteria grown in K1 medium with 4-chlorobenzoate acid isolated from sediment before irradiation suggests the presence of native bacteria with biodegradation potential of this compound.