A NTPDase2 é uma ectonucleotidase ancorada na membrana plasmática por dois domínios transmembrana, com o sítio catalítico voltado para o meio extracelular. Sua principal função é a hidrólise de nucleotídeos trifosfatados transformando‐os em difosfatados, mais fosfato inorgânico. Em menores proporções, também é capaz de hidrolisar nucleotídeos difosfatados. Sua função é remover ATP do meio extracelular, sendo que sua ausência causa acúmulo do nucleotídeo. Trabalhos anteriores demonstram que gliomas com superexpressão da NTPDase2 passaram a apresentar características de maior malignidade e agressividade. Tais peculiaridades, geralmente, são devido a alterações nas atividades de adesão, migração e proliferação celular, processos nos quais já foi demonstrado envolvimento de outras enzimas da mesma família, como a NTPDase1 e a Ecto‐5’‐nucleotidase in vitro. O envolvimento de proteínas com domínios ATPásicos na adesão celular é antigo na literatura. Entretanto, funções da NTPDase2 nestes mecanismos celulares ainda não foram estudadas in vitro. Por isso, nesse trabalho, a NTPDase2 foi superexpressa em células U87, GL261, Cos‐7 e Hek293 a fim de se estudar seu envolvimento nos processos biológicos de adesão, migração e proliferação celular in vitro. Nossos estudos mostraram que a superexpressão de NTPDase2 não altera a proliferação nem modula a migração celular. Entretanto, sua expressão diminui de maneira geral a adesão da linhagem Hek293 transduzidas sobre matrizes extracelulares, mas não modula a adesão sobre monocamada. A análise das imagens de microscopia confocal sugere que a enzima não se concentra na superfície de contato célula‐célula, sendo que quando as células estão sobre colágeno tipo I e fibronectina há uma concentração nas regiões de membrana livre. A medida do tempo para recuperação da fluorescência após “photobleaching” indica que sobre colágeno tipo I há uma velocidade de recuperação da fluorescência maior nas regiões de membrana livre. Nossos resultados demonstram que a NTPDase2 não co‐localiza com proteínas de complexos ou de adesão focal. Assim podemos concluir que a NTPDase2 fisicamente não modula a adesão célula‐célula ou célula‐matriz. / NTPDase2 is an ectonucleotidase anchored in the plasma membrane through two transmembrane domains, with the catalytic site facing the extracellular environment. Its main function is the hydrolysis of nucleotide triphosphates turning them into diphosphate nucleotides plus inorganic phosphate. To a lesser extent, it is also able to hydrolyze diphosphate nucleotides. As its function is to remove the extracellular ATP, its absence causes the accumulation of nucleotide. Previous works that reports the overexpression of NTPDase2 in gliomas shows that the cells began to exhibit features of increased malignancy and aggressiveness. Such peculiarities are usually due to changes in the activity of adhesion, migration and proliferation, processes in which it has been demonstrated involvement of other enzymes of the same family as the NTPDase1 and Ecto‐5'‐nucleotidase in vitro. The involvement of proteins with ATPase domain in adhesion is old in literature. However, functions of NTPDase2 in tumor biology have not been studied in vitro. So far, in this work, NTPDase2 was overexpressed into U87, GL261, Cos‐7 and Hek293 cells, in order to study its involvement in biological processes as adhesion, migration and cell proliferation, in vitro. Our studies show that overexpression of NTPDase2 do not alter the proliferation and do not modulate cell migration. However, its expression decreases the adhesion of transduced Hek293 cell line on extracellular matrices. Analyses of the images using a confocal microscope suggested that the enzyme do not concentrate at the cell‐cell contact surface. When the cells are cultured over collagen type I and fibronectin, there is a concentration of the protein in free membrane region. The time to fluorescence recovery after photobleaching indicates that in collagen type I there is an increased fluorescence recovery in free membrane regions. More over, our results in colocalization assay indicates that NTPDase2 is not located in focal complexes or focal adhesion. We can conclude that NTPDase2 do not physically modulate cell‐cell or cell‐matrix adhesion.

A NTPDase2 é uma ectonucleotidase ancorada na membrana plasmática por dois domínios transmembrana, com o sítio catalítico voltado para o meio extracelular. Sua principal função é a hidrólise de nucleotídeos trifosfatados transformando‐os em difosfatados, mais fosfato inorgânico. Em menores proporções, também é capaz de hidrolisar nucleotídeos difosfatados. Sua função é remover ATP do meio extracelular, sendo que sua ausência causa acúmulo do nucleotídeo. Trabalhos anteriores demonstram que gliomas com superexpressão da NTPDase2 passaram a apresentar características de maior malignidade e agressividade. Tais peculiaridades, geralmente, são devido a alterações nas atividades de adesão, migração e proliferação celular, processos nos quais já foi demonstrado envolvimento de outras enzimas da mesma família, como a NTPDase1 e a Ecto‐5’‐nucleotidase in vitro. O envolvimento de proteínas com domínios ATPásicos na adesão celular é antigo na literatura. Entretanto, funções da NTPDase2 nestes mecanismos celulares ainda não foram estudadas in vitro. Por isso, nesse trabalho, a NTPDase2 foi superexpressa em células U87, GL261, Cos‐7 e Hek293 a fim de se estudar seu envolvimento nos processos biológicos de adesão, migração e proliferação celular in vitro. Nossos estudos mostraram que a superexpressão de NTPDase2 não altera a proliferação nem modula a migração celular. Entretanto, sua expressão diminui de maneira geral a adesão da linhagem Hek293 transduzidas sobre matrizes extracelulares, mas não modula a adesão sobre monocamada. A análise das imagens de microscopia confocal sugere que a enzima não se concentra na superfície de contato célula‐célula, sendo que quando as células estão sobre colágeno tipo I e fibronectina há uma concentração nas regiões de membrana livre. A medida do tempo para recuperação da fluorescência após “photobleaching” indica que sobre colágeno tipo I há uma velocidade de recuperação da fluorescência maior nas regiões de membrana livre. Nossos resultados demonstram que a NTPDase2 não co‐localiza com proteínas de complexos ou de adesão focal. Assim podemos concluir que a NTPDase2 fisicamente não modula a adesão célula‐célula ou célula‐matriz. / NTPDase2 is an ectonucleotidase anchored in the plasma membrane through two transmembrane domains, with the catalytic site facing the extracellular environment. Its main function is the hydrolysis of nucleotide triphosphates turning them into diphosphate nucleotides plus inorganic phosphate. To a lesser extent, it is also able to hydrolyze diphosphate nucleotides. As its function is to remove the extracellular ATP, its absence causes the accumulation of nucleotide. Previous works that reports the overexpression of NTPDase2 in gliomas shows that the cells began to exhibit features of increased malignancy and aggressiveness. Such peculiarities are usually due to changes in the activity of adhesion, migration and proliferation, processes in which it has been demonstrated involvement of other enzymes of the same family as the NTPDase1 and Ecto‐5'‐nucleotidase in vitro. The involvement of proteins with ATPase domain in adhesion is old in literature. However, functions of NTPDase2 in tumor biology have not been studied in vitro. So far, in this work, NTPDase2 was overexpressed into U87, GL261, Cos‐7 and Hek293 cells, in order to study its involvement in biological processes as adhesion, migration and cell proliferation, in vitro. Our studies show that overexpression of NTPDase2 do not alter the proliferation and do not modulate cell migration. However, its expression decreases the adhesion of transduced Hek293 cell line on extracellular matrices. Analyses of the images using a confocal microscope suggested that the enzyme do not concentrate at the cell‐cell contact surface. When the cells are cultured over collagen type I and fibronectin, there is a concentration of the protein in free membrane region. The time to fluorescence recovery after photobleaching indicates that in collagen type I there is an increased fluorescence recovery in free membrane regions. More over, our results in colocalization assay indicates that NTPDase2 is not located in focal complexes or focal adhesion. We can conclude that NTPDase2 do not physically modulate cell‐cell or cell‐matrix adhesion.

A NTPDase2 é uma ectonucleotidase ancorada na membrana plasmática por dois domínios transmembrana, com o sítio catalítico voltado para o meio extracelular. Sua principal função é a hidrólise de nucleotídeos trifosfatados transformando‐os em difosfatados, mais fosfato inorgânico. Em menores proporções, também é capaz de hidrolisar nucleotídeos difosfatados. Sua função é remover ATP do meio extracelular, sendo que sua ausência causa acúmulo do nucleotídeo. Trabalhos anteriores demonstram que gliomas com superexpressão da NTPDase2 passaram a apresentar características de maior malignidade e agressividade. Tais peculiaridades, geralmente, são devido a alterações nas atividades de adesão, migração e proliferação celular, processos nos quais já foi demonstrado envolvimento de outras enzimas da mesma família, como a NTPDase1 e a Ecto‐5’‐nucleotidase in vitro. O envolvimento de proteínas com domínios ATPásicos na adesão celular é antigo na literatura. Entretanto, funções da NTPDase2 nestes mecanismos celulares ainda não foram estudadas in vitro. Por isso, nesse trabalho, a NTPDase2 foi superexpressa em células U87, GL261, Cos‐7 e Hek293 a fim de se estudar seu envolvimento nos processos biológicos de adesão, migração e proliferação celular in vitro. Nossos estudos mostraram que a superexpressão de NTPDase2 não altera a proliferação nem modula a migração celular. Entretanto, sua expressão diminui de maneira geral a adesão da linhagem Hek293 transduzidas sobre matrizes extracelulares, mas não modula a adesão sobre monocamada. A análise das imagens de microscopia confocal sugere que a enzima não se concentra na superfície de contato célula‐célula, sendo que quando as células estão sobre colágeno tipo I e fibronectina há uma concentração nas regiões de membrana livre. A medida do tempo para recuperação da fluorescência após “photobleaching” indica que sobre colágeno tipo I há uma velocidade de recuperação da fluorescência maior nas regiões de membrana livre. Nossos resultados demonstram que a NTPDase2 não co‐localiza com proteínas de complexos ou de adesão focal. Assim podemos concluir que a NTPDase2 fisicamente não modula a adesão célula‐célula ou célula‐matriz. / NTPDase2 is an ectonucleotidase anchored in the plasma membrane through two transmembrane domains, with the catalytic site facing the extracellular environment. Its main function is the hydrolysis of nucleotide triphosphates turning them into diphosphate nucleotides plus inorganic phosphate. To a lesser extent, it is also able to hydrolyze diphosphate nucleotides. As its function is to remove the extracellular ATP, its absence causes the accumulation of nucleotide. Previous works that reports the overexpression of NTPDase2 in gliomas shows that the cells began to exhibit features of increased malignancy and aggressiveness. Such peculiarities are usually due to changes in the activity of adhesion, migration and proliferation, processes in which it has been demonstrated involvement of other enzymes of the same family as the NTPDase1 and Ecto‐5'‐nucleotidase in vitro. The involvement of proteins with ATPase domain in adhesion is old in literature. However, functions of NTPDase2 in tumor biology have not been studied in vitro. So far, in this work, NTPDase2 was overexpressed into U87, GL261, Cos‐7 and Hek293 cells, in order to study its involvement in biological processes as adhesion, migration and cell proliferation, in vitro. Our studies show that overexpression of NTPDase2 do not alter the proliferation and do not modulate cell migration. However, its expression decreases the adhesion of transduced Hek293 cell line on extracellular matrices. Analyses of the images using a confocal microscope suggested that the enzyme do not concentrate at the cell‐cell contact surface. When the cells are cultured over collagen type I and fibronectin, there is a concentration of the protein in free membrane region. The time to fluorescence recovery after photobleaching indicates that in collagen type I there is an increased fluorescence recovery in free membrane regions. More over, our results in colocalization assay indicates that NTPDase2 is not located in focal complexes or focal adhesion. We can conclude that NTPDase2 do not physically modulate cell‐cell or cell‐matrix adhesion.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

A Eletroconvulsoterapia é atualmente o método mais efetivo no manejo dos transtornos depressivos, e sua superioridade frente ao tratamento farmacológico apresenta-se bem documentada. Apesar disso, críticos ainda vêem o método como potencialmente danoso e capaz de provocar lesões cerebrais, fatos que carecem de comprovação científica. Hipóteses quanto aos mecanismos bioquímicos desencadeados pela eletroconvulsoterapia, bem como pelos antidepressivos de um modo geral, voltam-se tradicionalmente para o sistema monoaminérgico como principal envolvido na orquestração subjacente à recuperação dos sintomas de humor. Há algum tempo esforços têm sido direcionados para identificação de outros sistemas que possam estar desempenhando um importante papel. Nesta tese utilizamos um tradicional modelo de choque eletroconvulsivo em ratos para investigar seus efeitos sobre marcadores de lesão neuronal, atividade e consumo energético glial, bem como atividade de ectonucleotidases. Ratos wistar machos com 60 a 90 dias de idade foram alocados a dois tratamentos. No primeiro, denominado agudo, os indivíduos receberam um único choque eletroconvulsivo, sendo posteriormente sacrificados em horários predeterminados. No segundo modelo, crônico, os ratos receberam 8 choques eletroconvulsivos, mimetizando um curso de tratamento de eletroconvulsoterapia. O sacrifício dos ratos no modelo crônico ocorreu após o oitavo choque, também em momentos predeterminados. No primeiro trabalho foi extraído o líquor dos animais 0, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após terminadas as sessões, sendo medidos os níveis de proteína S100B, enolase específica do neurônio e lactato. Os níveis de S100B apresentavam-se significativamente elevados seis horas após o último choque no modelo crônico (p<0,0001). Enolase específica do neurônio não teve alterações, e os níveis de lactato aumentaram significativamente na primeira medição após o choque, tanto no modelo crônico quanto no agudo (p<0,001, para ambos). No segundo trabalho, o mesmo modelo foi usado, agora com medições nos níveis séricos da hidrólise de nucleotídeos da adenina. Nosso modelo agudo demonstrou uma diminuição significativa da hidrólise de ATP, ADP e AMP, no primeiro momento medido após o choque, 0 horas (p<0,05 para ATP, e p<0,01 para ADP e AMP), enquanto no modelo crônico avaliou-se que a atividade sérica da enzima aumentava significativamente 48 horas após o último choque (p<0,05 para os três nucleotídeos), permanecendo significativamente aumentada 7 dias após (p<0,001 para os três nucleotídeos). Assim, os resultados do primeiro trabalho apóiam a proposta de que o choque eletroconvulsivo não produz dano neural, e que as alterações observadas nos níveis de S100B e lactato, refletem uma reação astrocitária de natureza protetora. No segundo observamos que o modelo crônico de choque eletroconvulsivo é capaz de induzir ativações enzimáticas sustentadas, o que pode apoiar a idéia de que a adenosina esteja associada com os mecanismos bioquímicos envolvidos nas mudanças cerebrais ocasionadas pela eletroconvulsoterapia.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

A Eletroconvulsoterapia é atualmente o método mais efetivo no manejo dos transtornos depressivos, e sua superioridade frente ao tratamento farmacológico apresenta-se bem documentada. Apesar disso, críticos ainda vêem o método como potencialmente danoso e capaz de provocar lesões cerebrais, fatos que carecem de comprovação científica. Hipóteses quanto aos mecanismos bioquímicos desencadeados pela eletroconvulsoterapia, bem como pelos antidepressivos de um modo geral, voltam-se tradicionalmente para o sistema monoaminérgico como principal envolvido na orquestração subjacente à recuperação dos sintomas de humor. Há algum tempo esforços têm sido direcionados para identificação de outros sistemas que possam estar desempenhando um importante papel. Nesta tese utilizamos um tradicional modelo de choque eletroconvulsivo em ratos para investigar seus efeitos sobre marcadores de lesão neuronal, atividade e consumo energético glial, bem como atividade de ectonucleotidases. Ratos wistar machos com 60 a 90 dias de idade foram alocados a dois tratamentos. No primeiro, denominado agudo, os indivíduos receberam um único choque eletroconvulsivo, sendo posteriormente sacrificados em horários predeterminados. No segundo modelo, crônico, os ratos receberam 8 choques eletroconvulsivos, mimetizando um curso de tratamento de eletroconvulsoterapia. O sacrifício dos ratos no modelo crônico ocorreu após o oitavo choque, também em momentos predeterminados. No primeiro trabalho foi extraído o líquor dos animais 0, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após terminadas as sessões, sendo medidos os níveis de proteína S100B, enolase específica do neurônio e lactato. Os níveis de S100B apresentavam-se significativamente elevados seis horas após o último choque no modelo crônico (p<0,0001). Enolase específica do neurônio não teve alterações, e os níveis de lactato aumentaram significativamente na primeira medição após o choque, tanto no modelo crônico quanto no agudo (p<0,001, para ambos). No segundo trabalho, o mesmo modelo foi usado, agora com medições nos níveis séricos da hidrólise de nucleotídeos da adenina. Nosso modelo agudo demonstrou uma diminuição significativa da hidrólise de ATP, ADP e AMP, no primeiro momento medido após o choque, 0 horas (p<0,05 para ATP, e p<0,01 para ADP e AMP), enquanto no modelo crônico avaliou-se que a atividade sérica da enzima aumentava significativamente 48 horas após o último choque (p<0,05 para os três nucleotídeos), permanecendo significativamente aumentada 7 dias após (p<0,001 para os três nucleotídeos). Assim, os resultados do primeiro trabalho apóiam a proposta de que o choque eletroconvulsivo não produz dano neural, e que as alterações observadas nos níveis de S100B e lactato, refletem uma reação astrocitária de natureza protetora. No segundo observamos que o modelo crônico de choque eletroconvulsivo é capaz de induzir ativações enzimáticas sustentadas, o que pode apoiar a idéia de que a adenosina esteja associada com os mecanismos bioquímicos envolvidos nas mudanças cerebrais ocasionadas pela eletroconvulsoterapia.

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

A Eletroconvulsoterapia é atualmente o método mais efetivo no manejo dos transtornos depressivos, e sua superioridade frente ao tratamento farmacológico apresenta-se bem documentada. Apesar disso, críticos ainda vêem o método como potencialmente danoso e capaz de provocar lesões cerebrais, fatos que carecem de comprovação científica. Hipóteses quanto aos mecanismos bioquímicos desencadeados pela eletroconvulsoterapia, bem como pelos antidepressivos de um modo geral, voltam-se tradicionalmente para o sistema monoaminérgico como principal envolvido na orquestração subjacente à recuperação dos sintomas de humor. Há algum tempo esforços têm sido direcionados para identificação de outros sistemas que possam estar desempenhando um importante papel. Nesta tese utilizamos um tradicional modelo de choque eletroconvulsivo em ratos para investigar seus efeitos sobre marcadores de lesão neuronal, atividade e consumo energético glial, bem como atividade de ectonucleotidases. Ratos wistar machos com 60 a 90 dias de idade foram alocados a dois tratamentos. No primeiro, denominado agudo, os indivíduos receberam um único choque eletroconvulsivo, sendo posteriormente sacrificados em horários predeterminados. No segundo modelo, crônico, os ratos receberam 8 choques eletroconvulsivos, mimetizando um curso de tratamento de eletroconvulsoterapia. O sacrifício dos ratos no modelo crônico ocorreu após o oitavo choque, também em momentos predeterminados. No primeiro trabalho foi extraído o líquor dos animais 0, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após terminadas as sessões, sendo medidos os níveis de proteína S100B, enolase específica do neurônio e lactato. Os níveis de S100B apresentavam-se significativamente elevados seis horas após o último choque no modelo crônico (p<0,0001). Enolase específica do neurônio não teve alterações, e os níveis de lactato aumentaram significativamente na primeira medição após o choque, tanto no modelo crônico quanto no agudo (p<0,001, para ambos). No segundo trabalho, o mesmo modelo foi usado, agora com medições nos níveis séricos da hidrólise de nucleotídeos da adenina. Nosso modelo agudo demonstrou uma diminuição significativa da hidrólise de ATP, ADP e AMP, no primeiro momento medido após o choque, 0 horas (p<0,05 para ATP, e p<0,01 para ADP e AMP), enquanto no modelo crônico avaliou-se que a atividade sérica da enzima aumentava significativamente 48 horas após o último choque (p<0,05 para os três nucleotídeos), permanecendo significativamente aumentada 7 dias após (p<0,001 para os três nucleotídeos). Assim, os resultados do primeiro trabalho apóiam a proposta de que o choque eletroconvulsivo não produz dano neural, e que as alterações observadas nos níveis de S100B e lactato, refletem uma reação astrocitária de natureza protetora. No segundo observamos que o modelo crônico de choque eletroconvulsivo é capaz de induzir ativações enzimáticas sustentadas, o que pode apoiar a idéia de que a adenosina esteja associada com os mecanismos bioquímicos envolvidos nas mudanças cerebrais ocasionadas pela eletroconvulsoterapia.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.