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The contents of this thesis describes the development of an analytical method to determine the chemical speciation of heavy metals in soils contaminted by sewage sludge and distillery wastes. Chapter one serves as an introduction discussing the various heavy metal species that can occur in soils. The chapter also contains a review of the analytical methods that have already been used in speciation studies and discusses their suitability for this particular problem. Chapter two is mainly concerned with the derivation of a relationship between the electrical conductivity and ionic strength of soil solutions. Chapter three describes the development of suitable sampling techniques for the study of chemical speciation in soils. Chapter four describes rhe development of the size Exclusion Chromatography (SEC) separation technique chosen to separate the species of interest. The chapter also describes how this technique was interfaced to Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry in order to detect the copper content of the various soil solution species. Chapter five extends the above technique to the studv of the long term partioning of copper in water extracts of sewage sludge and distillery waste polluted soils and compares the results with those obtained from previous studies on the same sampling sites. Chapter six investigates the possibility of utilizing Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry as a detector for the SEC separation technique. Chapter seven contains suggestions for future research.

The introduction of lux genes, able to express bioluminescence, into terrestrial bacteria enabled the optimisation of a bioluminescence-based bioassay that was environmentally relevant. Individual assay parameters such as growth phase, cell washing, lyophilisation, pH tolerance and temporal response to a range of metal and xenobiotic pollutants were evaluated. The effects of a range of pollutants upon the metabolic response of the lux-marked organisms were assessed using declines in bioluminescence. The lux -based bioassay proved more sensitive to the sub-lethal effects of metal pollutants than tests relying on culturability. Uncontaminated soils were spiked with metal and xenobiotic solutions both as single pollutants and in combination with other contaminants. Relative toxicity of metal and xenobiotic pollutants in soil systems were investigated using ecotoxicity assays based upon lux-marked constructs of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii (an important associative nitrogen fixer) and the respiration of the microbial community. The lux-marked bioassay proved to be more sensitive than the community microbial assay to the presence of multiple contaminants at sub-lethal concentrations. The relative toxicities of metal and organic xenobiotic compounds were shown to be time dependent and better represented using chronic assaying of lux-marked microorganisms. Following a field trial involving the application of paper mill sludge to land and subsequent crop failure a rapid diagnosis of soil pollutants was required. A suite of ecotoxicity assays including lux-based bioassays, respirometry and enzyme activity were used to assess the toxicity of paper mill sludge to the soil microbial biomass. The selected lux-marked soil bacteria showed potential for use as rapid, field-based screening techniques to provide early warning of the potential hazards of waste application.

The aim of this study was to develop a suitable monitoring protocol for mediated amperometric whole-cell biosensors for in situ assessment of heavy metals in soil. E. coli 8277, Pseudomonas 9773, Pseudomonas 9046 and Pseudomonas 8917 were screened as biosensor catalysts to select the sensitive biosensor configurations to heavy metals. A new protocol was developed for monitoring heavy metals in defined solution, soil pore water, and in situ in soil. This study also demonstrated the applications of mediated amperometric bacterial biosensors for in situ assessing the bioavailability and toxicity of heavy metals in freshly spiked soils or historically contaminated soils, and mixture toxicities of heavy metals. It was found that the biosensors incorporating selected bacterial strains were appropriately sensitive to copper, but less sensitive to Zn, Pb, and Hg, compared to Microtox assay. The advantage of the mediated amperometric bacterial biosensor system is its in situ application in soils. The present study demonstrated that soil pore water does not accurately reflect conditions of soil ecosystem, and that in situ bioassays are more reliable for determining the bioavailability and toxicity of heavy metals. This is the first reported use of disposable whole cell biosensors for in situ heavy metal bioavailability and toxicity assessment. The biosensor protocol developed here can be adapted to allow the incorporation of dfferent bacterial biocatalysts for applications in soil quality assessment, screening of sites for contamination ‘hot spots’, and the evaluation of soil degradation or rehabilitation from metal pollution. Mediated amperometric bacterial biosensors are not analyte specific, their response reflecting the metabolic impact of the combined chemical and physical properties of the environment to which they are exposed. In assessing the toxicity of soil samples from fields using these biosensors, it is vital to get appropriate control soil samples. The conditions of soil samples also need to be well defined. The sensitivity of the mediated amperometric whole-cell biosensors to heavy metals need to be further improved. Investigations are also required to determine how the natural conditions affect the application of the biosensor system in the field.

Os fungos são decompositores primários e, portanto, ocupam uma posição estratégica na base da cadeia alimentar em diversos ecossistemas, incluindo os terrestres. Por tais características, estes organismos são de especial interesse na aplicação em bioensaios de toxicidade. As metodologias com espécies bioluminescentes são geralmente práticas, economicamente viáveis e de fácil aplicação. Ainda assim, os fungos naturalmente bioluminescentes são ainda pouco estudados para este propósito, em comparação com os organismos aquáticos, como as bactérias. Neste cenário, o presente trabalho apresenta os efeitos de diferentes condições de cultivo sobre o perfil de bioluminescência do fungo Neonothopanus gardneri, buscando o desenvolvimento de um bioensaio de toxicidade utilizando esta espécie. Estudos preliminares foram destinados à redução da variação experimental, à identificação de algumas das características intrínsecas do organismo em cultura e, ainda, à definição de procedimentos de análise e de inoculação do micélio. Em seguida, a emissão de luz foi monitorada variando as temperaturas de incubação, o pH dos meios de cultura e as concentrações das fontes de carbono e de nitrogênio, adotadas como nutrientes. Identificou-se que a incubação a 30ºC em meios com 2% de ágar, 1% de melaço de cana de açúcar, 0,02% de extrato de levedura e pH 6 resultou em um perfil de bioluminescência mais adequado ao propósito de interesse, apesar de não ter resultado na maior emissão de luz possível. Nestas condições de cultivo, foi possível desenvolver um bioensaio de toxicidade. Para isso, foi necessário avaliar o comportamento da luz emitida pelo micélio em contato tanto com ar atmosférico quanto com alguns potenciais diluentes, estabelecendo-se também o tempo de exposição necessário para uma resposta máxima do fungo N. gardneri em contato com soluções de Cu+2 (50 mM) e fenol (10 mM). Neste caso, uma solução aquosa de Triton X-100 na concentração de 0,01% (m:v) tamponada com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico (MES, 50 mM, pH 5,7) foi adotada para diluir os agentes tóxicos, aos quais o micélio foi exposto durante 24 horas. Posteriormente, a metodologia foi aplicada para testar a toxicidade de dois metais e dois fenóis (Cu+2, Cd+2, fenol e 4-nitrofenol), obtendo-se respectivos valores de EC50 (concentração mediana efetiva) iguais a (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Entretanto, em experimentos paralelos, a quantificação espectrofotométrica de fenóis nos meios de cultura indicou que os mesmos são difundidos homogeneamente pelo ágar. Neste caso, os valores de EC50 seriam divididos por 6, para considerar a diluição dos compostos pelos meios. O bioensaio com a espécie N. gardneri possui vantagens, principalmente em relação ao comportamento reprodutível da emissão de luz, à alta intensidade da bioluminescência, ao crescimento rápido do micélio e à sensibilidade aos agentes tóxicos testados. Considerando tais características, a metodologia desenvolvida representa um procedimento viável em bioensaios de toxicidade. Assim, a mesma pode ser aperfeiçoada em trabalhos futuros e aplicada em complemento com outros métodos já desenvolvidos para outros organismos terrestres ou aquáticos. / Fungi are primary decomposers, thus occupying a strategic position at the base of the food chain in many ecosystems, including terrestrial ones. Due to such characteristics, these organisms are of special interest to toxicity bioassays. Bioluminescent-based methods are usually practical, economically viable and easy to perform. Nevertheless, naturally bioluminscent fungi are still poorly studied in this respect, compared to aquatic organisms like bacteria. In the above mentioned scenario, this work presents the effects of different culture conditions on the bioluminescence profile of the fungus Neonothopanus gardneri, aiming at the development of a toxicity bioassay using this species. Preliminary studies were intended to reduce experimental variation, identify some of the intrinsic characteristics of the organism in culture, and also to define the procedures for analysis and mycelium inoculation. Following this, light emission was monitored varying the incubation temperatures; the culture media pH and the concentrations of carbon and nitrogen nutrient sources. It was identified that the incubation at 30ºC in culture media containing 2% agar, 1% sugar cane molasses, 0.02% yeast extract and pH 6 resulted in the most appropriate bioluminescence profile for the purpose of interest, although it has not resulted in the higher light emission. Under these culturing conditions, it was possible to develop a toxicity bioassay. To this end, it was necessary to assess the behavior of light emission from the mycelium in contact with both atmospheric air and some potential diluents, also establishing the exposure time required for a maximum response of N. gardneri in contact with Cu+2 (50 mM) and phenol (10 mM) solutions. In this case, an aqueous solution of Triton X-100 in the concentration of 0.01% (w:v) buffered with 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES, 50 mM) was chosen to dilute the toxic agents, to which the mycelium was exposed for 24 hours. Thereafter, the methodology was applied to test the toxicity of two metals and two phenols (Cu+2, Cd+2, phenol and 4-nitrophenol), obtaining respective EC50 values (median effective concentration) equal to (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Meanwhile, in parallel experiments, the spectrophotometric quantification of phenols in culture media indicated that they are evenly diffused through agar. In this case, the EC50 values would be divided by 6, in order to consider the dilution of compounds by the media. The toxicity bioassay with N. gardneri species has advantages, manly in relation to the reproducible behavior of light emission, high intensity of bioluminescence, rapid growth of mycelium and sensitivity to the tested toxic agents. Considering these characteristics, the developed methodology represents a viable procedure for a toxicological bioassay. Accordingly, it can be improved in future work and performed in addition to other methods already developed for other terrestrial or aquatic organisms.

Os solos brasileiros são predominantemente ácidos, ocorrência comum nas regiões tropicais. Esta condição, aliada a outros fatores abióticos e bióticos, pode resultar em toxicidade de manganês (Mn) às plantas, o que limita o seu desenvolvimento. A utilização de práticas agrícolas convencionais propicia o aumento da toxidez de Mn, à medida que reduz o teor de matéria orgânica. Para atenuar este problema, algumas práticas como a calagem e o melhoramento genético são amplamente utilizados. Entretanto, a utilização de alternativas de manejo da cultura através do uso da simbiose micorrízica, para induzir maior resistência das plantas a altos níveis de Mn, parece bastante promissora. Para investigar possíveis mecanismos de indução da resistência e interações de nutrientes no controle da toxicidade de Mn em soja, foram avaliados o crescimento, a absorção e a acumulação de Mn, Fe, P e Ca e a atividade de catalase, peroxidase, superóxido dismutase e oxidase de AIA, nas folhas e raízes das plantas micorrizadas e não micorrizadas, além do nível de colonização de raízes pelo fungo micorrízico arbuscular (FMA). A planta teste foi a soja (Glycine max L. Merr. CV. IAC 8-2). O experimento foi executado em casa de vegetação, em vasos preenchidos com 4 Kg de solo classificado como Neossolo Quartzarênico típico, previamente autoclavado para eliminar fungos micorrízicos arbusculares. O delineamento foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial, 4x5: dois isolados de FMA, Glomus etunicatum e Glomus macrocarpum, cada qual com 30 mg kg -1 de P adicionado ao substrato e dois controles não inoculados, sendo um com 30 mg kg -1 e outro com 50 mg kg -1 de P, 5 níveis de Mn (0, 5, 10, 20, 40 mg kg -1 ). Foram realizadas duas épocas distintas de colheita, aos 45 e 90 dias. As atividades enzimáticas foram avaliadas pelo método PAGE não-denaturante através de análise visual. Os resultados demonstram que níveis de Mn entre 10 e 40 mg kg -1 no substrato podem induzir respostas de toxidez de Mn em plantas de soja, acompanhadas de redução de crescimento e alterações no padrão de absorção de vários nutrientes vegetais. O aumento da dose de P e a presença da micorriza são fatores de atenuação da toxidez de Mn em soja, visto que plantas micorrizadas contêm menor concentração de Mn em seus tecidos e, de uma maneira geral, menor atividade enzimática de peroxidase (PO) e oxidase do ácido-indolacético (AIA) do que as plantas controles. Aumentos no nível de Mn do substrato podem causar um aumento da atividade de PO e de oxidase de AIA nas plantas, sendo que as plantas mais estressadas quase sempre apresentam maior atividade dessas enzimas. Apesar da superóxido dismutase (SOD) ser também enzima antioxidativa, apresenta um padrão eletroforético diferenciado da PO, sendo que na raiz sua maior atividade está correlacionada com a presença do FMA. / Brazilian soils are predominantly acid, which is considered a common incident in tropical regions. Soil acidity in combination with biotic and non-biotic factors can result manganese toxicity in plants, limiting their development. The use of conventional agricultural practices promotes an increase in Mn toxicity, as it reduces the soil content of organic matter. This problem can be minimized by the use of some tilling practicies like liming and breeding, which are widely used. However, crop management alternatives through the use of mycorrhizae to induce greater Mn tolerance in plants under high levels of Mn seem to be promising. In this work, plant growth, the absorption, distibution of Mn, Fe, P, Ca and activity of catalase, peroxidase, superoxide dismutase and indolacetic acid oxidase were evaluated in leaves and roots of plants inoculated with mycorrhizal fungi and non-inoculated ones, to invetigate a possible resistance induction mechanism and nutrient interactions in control of toxic levels of Mn. A greenhouse experiment was conducted with soybean plant (Glycine max L. Merr. CV. IAC 8-2) in a completely randomized factorial design 4x5: inoculation of two different arbuscular mycorrhizal fungi (AMF): Glomus etunicatum and Glomus macrocarpum, which received 30 mg kg -1 of P, and two non-inoculated controls, one that received 30 mg kg -1 and the other with 50 mg kg -1 of P; 5 levels of Mn (0, 5, 10, 20, 40 mg kg -1 ). There were two harvest periods, 45 and 90 days. The enzymatic activities were evaluated in non-denaturing polyacrilamyde gel eletrophoresis (PAGE). Manganese levels between 10 and 40 mg kg -1 in the substrate can induce Mn toxicity in soybean plants, that results in a growth reduction and in alterations in the nuttrient absorption alterations of the plants. The increase of P and the presence of mycorrhizae result in the alleviation of Mn toxicity in soybean plants. Micorrhizal plants present lower Mn concentration and generally less enzymatic activity of indolacetic acid oxidase and peroxidase than control plants. Although both, peroxidase and superoxide dismutase are antioxidant enzymes, they present differentiated electrophoretic standards. Most of the time peroxidase and indolacetic acid oxidase activities increase due to increasing Mn levels. Superoxide dismutase activity, however, is higher in the shoots of micorrhizal plants when compared to control plants.

A determinação de elementos tóxicos em solo é uma importante ferramenta para monitorar a poluição ambiental. O cádmio é um elemento potencialmente tóxico às plantas, aos animais superiores e ao homem, podendo estar presente no ambiente, natural ou antropicamente, em condição de causar toxicidade. Pouco se conhece sobre o comportamento desse cátion nos solos tropicais muito intemperizados, e que apresentam atributos diferentes daqueles de regiões temperadas onde a maioria dos estudos têm sido conduzidos. Esse trabalho teve como objetivos verificar: a) a extratabilidade do cádmio nas amostras de solos naturais com extratores químicos convencionais como o DTPA-TEA pH 7,3, o Mehlich 3 e o CaCl2 0,01 mol L -1 relacionando-a com os diversos atributos dos solos, b) a potencialidade de extração do Cd pelo uso de soluções de ácidos orgânicos de baixo peso molecular (acético, cítrico e oxálico) que foi comparada com os extratores convencionais e c) a extratabilidade do cádmio em amostras de solos provenientes de regiõescontaminadas usando-se os mesmos extratores convencionais e orgânicos. As relações solo:solução utilizadas foram para Mehlich 3, DTPA-TEA pH 7,3, CaCl2 0,01 mol L -1 , ácido acético 57 mmol L -1 , ácido cítrico 2,1 mmol L -1 e ácido oxálico 10,4 mmol L -1 , respectivamente, as seguintes: 2,5:25; 10:20; 1:10; 10:20; 10:20 e 10:20 (g/ml). Foram feitas análises de regressão simples obtendo-se correlação negativa significativa (r = 0,73) entre o Cd extraído pelo DTPA-TEA pH 7,3 e o teor de argila dos solos naturais, entre o extrator e o teor de ferro livre (r = 0,65) e entre o extrator e o pH em KCl 1 mol L -1 (r = 0,47). Análises de regressão múltipla também foram feitas obtendo-se correlação negativa significativa (R 2 = 0,528) entre o DTPA-TEA pH 7,3 e o teor de argila. O extrator DTPA-TEA pH 7,3 foi o que apresentou diferença significativa e maior extratabilidade de Cd em solos naturais. As soluções de CaCl2 0,01 mol L -1 e os ácidos orgânicos extraíram pequena quantidade de Cd dos solos naturais. Para as amostras de solos contaminados a solução de ácido acético foi a que mostrou maior potencialidade de extração do elemento. / The determination of toxic elements in the soil is an important tool for monitoring environmental pollution. Cadmium is an element potentially toxic to the plants, superior animals and man. Not too much is known about of this cation the behaviour in the very weathered tropical soils which present different attributes from the areas where most of the studies has ben conducted. The objectives of this paper was to verify: a) the extractability of cadmium in natural and contaminated soil samples with the addition of chemical extractants DTPA-TEA pH 7,3, MEHLICH 3 and CaCl2 0,01 mol L -1 and relate the amount extracted with different soil attributes, b) the extractability potential of three low-molecular- weight organic acids (acetic, citric and oxalic acids) and compare to the conventional extractants and c) the extratibility of cadmium in soil samples from polluted areas with the same conventional and organic extractants. The> soil:solution ratios used for Mehlich 3, DTPA-TEA pH 7,3, CaCl2 0,01 mol L -1 , acetic acid 57 mmol L -1 , citric acid 2,1 mmol L -1 and oxalic acid 10,4 mmol L -1 , were respectively, the following: 2,5:25; 10:20; 1:10; 10:20; 10:20 and 10:20 (m/v). Simple linear regression analysis showed negative correlations (r = -0,73) just for DTPA-TEA pH 7,3 extractable Cd and soil clay content, and free Fe content (r = -0,65) and pH in KCl solution (r = -0,47). Multiple regression analysis was also performed and a significant negative correlations (R 2 = 0,528) obtained just for DTPA-TEA pH 7,3 extractable cadmium and soil clay content. The DTPA-TEA pH 7,3 extractant presented the highest results for Cd extratability in natural soils. The CaCl2 0,01 mol L -1 and organic acids solutions extracted very low amount of Cd in natural soils, almost always near the detection limit of the equipament. For contaminated soil samples the acetic acid solution presented the biggest extraction potential for Cd.

A determinação de elementos tóxicos em solo é uma importante ferramenta para monitorar a poluição ambiental. O cádmio é um elemento potencialmente tóxico às plantas, aos animais superiores e ao homem, podendo estar presente no ambiente, natural ou antropicamente, em condição de causar toxicidade. Pouco se conhece sobre o comportamento desse cátion nos solos tropicais muito intemperizados, e que apresentam atributos diferentes daqueles de regiões temperadas onde a maioria dos estudos têm sido conduzidos. Esse trabalho teve como objetivos verificar: a) a extratabilidade do cádmio nas amostras de solos naturais com extratores químicos convencionais como o DTPA-TEA pH 7,3, o Mehlich 3 e o CaCl2 0,01 mol L -1 relacionando-a com os diversos atributos dos solos, b) a potencialidade de extração do Cd pelo uso de soluções de ácidos orgânicos de baixo peso molecular (acético, cítrico e oxálico) que foi comparada com os extratores convencionais e c) a extratabilidade do cádmio em amostras de solos provenientes de regiõescontaminadas usando-se os mesmos extratores convencionais e orgânicos. As relações solo:solução utilizadas foram para Mehlich 3, DTPA-TEA pH 7,3, CaCl2 0,01 mol L -1 , ácido acético 57 mmol L -1 , ácido cítrico 2,1 mmol L -1 e ácido oxálico 10,4 mmol L -1 , respectivamente, as seguintes: 2,5:25; 10:20; 1:10; 10:20; 10:20 e 10:20 (g/ml). Foram feitas análises de regressão simples obtendo-se correlação negativa significativa (r = 0,73) entre o Cd extraído pelo DTPA-TEA pH 7,3 e o teor de argila dos solos naturais, entre o extrator e o teor de ferro livre (r = 0,65) e entre o extrator e o pH em KCl 1 mol L -1 (r = 0,47). Análises de regressão múltipla também foram feitas obtendo-se correlação negativa significativa (R 2 = 0,528) entre o DTPA-TEA pH 7,3 e o teor de argila. O extrator DTPA-TEA pH 7,3 foi o que apresentou diferença significativa e maior extratabilidade de Cd em solos naturais. As soluções de CaCl2 0,01 mol L -1 e os ácidos orgânicos extraíram pequena quantidade de Cd dos solos naturais. Para as amostras de solos contaminados a solução de ácido acético foi a que mostrou maior potencialidade de extração do elemento. / The determination of toxic elements in the soil is an important tool for monitoring environmental pollution. Cadmium is an element potentially toxic to the plants, superior animals and man. Not too much is known about of this cation the behaviour in the very weathered tropical soils which present different attributes from the areas where most of the studies has ben conducted. The objectives of this paper was to verify: a) the extractability of cadmium in natural and contaminated soil samples with the addition of chemical extractants DTPA-TEA pH 7,3, MEHLICH 3 and CaCl2 0,01 mol L -1 and relate the amount extracted with different soil attributes, b) the extractability potential of three low-molecular- weight organic acids (acetic, citric and oxalic acids) and compare to the conventional extractants and c) the extratibility of cadmium in soil samples from polluted areas with the same conventional and organic extractants. The> soil:solution ratios used for Mehlich 3, DTPA-TEA pH 7,3, CaCl2 0,01 mol L -1 , acetic acid 57 mmol L -1 , citric acid 2,1 mmol L -1 and oxalic acid 10,4 mmol L -1 , were respectively, the following: 2,5:25; 10:20; 1:10; 10:20; 10:20 and 10:20 (m/v). Simple linear regression analysis showed negative correlations (r = -0,73) just for DTPA-TEA pH 7,3 extractable Cd and soil clay content, and free Fe content (r = -0,65) and pH in KCl solution (r = -0,47). Multiple regression analysis was also performed and a significant negative correlations (R 2 = 0,528) obtained just for DTPA-TEA pH 7,3 extractable cadmium and soil clay content. The DTPA-TEA pH 7,3 extractant presented the highest results for Cd extratability in natural soils. The CaCl2 0,01 mol L -1 and organic acids solutions extracted very low amount of Cd in natural soils, almost always near the detection limit of the equipament. For contaminated soil samples the acetic acid solution presented the biggest extraction potential for Cd.

Os fungos são decompositores primários e, portanto, ocupam uma posição estratégica na base da cadeia alimentar em diversos ecossistemas, incluindo os terrestres. Por tais características, estes organismos são de especial interesse na aplicação em bioensaios de toxicidade. As metodologias com espécies bioluminescentes são geralmente práticas, economicamente viáveis e de fácil aplicação. Ainda assim, os fungos naturalmente bioluminescentes são ainda pouco estudados para este propósito, em comparação com os organismos aquáticos, como as bactérias. Neste cenário, o presente trabalho apresenta os efeitos de diferentes condições de cultivo sobre o perfil de bioluminescência do fungo Neonothopanus gardneri, buscando o desenvolvimento de um bioensaio de toxicidade utilizando esta espécie. Estudos preliminares foram destinados à redução da variação experimental, à identificação de algumas das características intrínsecas do organismo em cultura e, ainda, à definição de procedimentos de análise e de inoculação do micélio. Em seguida, a emissão de luz foi monitorada variando as temperaturas de incubação, o pH dos meios de cultura e as concentrações das fontes de carbono e de nitrogênio, adotadas como nutrientes. Identificou-se que a incubação a 30ºC em meios com 2% de ágar, 1% de melaço de cana de açúcar, 0,02% de extrato de levedura e pH 6 resultou em um perfil de bioluminescência mais adequado ao propósito de interesse, apesar de não ter resultado na maior emissão de luz possível. Nestas condições de cultivo, foi possível desenvolver um bioensaio de toxicidade. Para isso, foi necessário avaliar o comportamento da luz emitida pelo micélio em contato tanto com ar atmosférico quanto com alguns potenciais diluentes, estabelecendo-se também o tempo de exposição necessário para uma resposta máxima do fungo N. gardneri em contato com soluções de Cu+2 (50 mM) e fenol (10 mM). Neste caso, uma solução aquosa de Triton X-100 na concentração de 0,01% (m:v) tamponada com ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico (MES, 50 mM, pH 5,7) foi adotada para diluir os agentes tóxicos, aos quais o micélio foi exposto durante 24 horas. Posteriormente, a metodologia foi aplicada para testar a toxicidade de dois metais e dois fenóis (Cu+2, Cd+2, fenol e 4-nitrofenol), obtendo-se respectivos valores de EC50 (concentração mediana efetiva) iguais a (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Entretanto, em experimentos paralelos, a quantificação espectrofotométrica de fenóis nos meios de cultura indicou que os mesmos são difundidos homogeneamente pelo ágar. Neste caso, os valores de EC50 seriam divididos por 6, para considerar a diluição dos compostos pelos meios. O bioensaio com a espécie N. gardneri possui vantagens, principalmente em relação ao comportamento reprodutível da emissão de luz, à alta intensidade da bioluminescência, ao crescimento rápido do micélio e à sensibilidade aos agentes tóxicos testados. Considerando tais características, a metodologia desenvolvida representa um procedimento viável em bioensaios de toxicidade. Assim, a mesma pode ser aperfeiçoada em trabalhos futuros e aplicada em complemento com outros métodos já desenvolvidos para outros organismos terrestres ou aquáticos. / Fungi are primary decomposers, thus occupying a strategic position at the base of the food chain in many ecosystems, including terrestrial ones. Due to such characteristics, these organisms are of special interest to toxicity bioassays. Bioluminescent-based methods are usually practical, economically viable and easy to perform. Nevertheless, naturally bioluminscent fungi are still poorly studied in this respect, compared to aquatic organisms like bacteria. In the above mentioned scenario, this work presents the effects of different culture conditions on the bioluminescence profile of the fungus Neonothopanus gardneri, aiming at the development of a toxicity bioassay using this species. Preliminary studies were intended to reduce experimental variation, identify some of the intrinsic characteristics of the organism in culture, and also to define the procedures for analysis and mycelium inoculation. Following this, light emission was monitored varying the incubation temperatures; the culture media pH and the concentrations of carbon and nitrogen nutrient sources. It was identified that the incubation at 30ºC in culture media containing 2% agar, 1% sugar cane molasses, 0.02% yeast extract and pH 6 resulted in the most appropriate bioluminescence profile for the purpose of interest, although it has not resulted in the higher light emission. Under these culturing conditions, it was possible to develop a toxicity bioassay. To this end, it was necessary to assess the behavior of light emission from the mycelium in contact with both atmospheric air and some potential diluents, also establishing the exposure time required for a maximum response of N. gardneri in contact with Cu+2 (50 mM) and phenol (10 mM) solutions. In this case, an aqueous solution of Triton X-100 in the concentration of 0.01% (w:v) buffered with 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES, 50 mM) was chosen to dilute the toxic agents, to which the mycelium was exposed for 24 hours. Thereafter, the methodology was applied to test the toxicity of two metals and two phenols (Cu+2, Cd+2, phenol and 4-nitrophenol), obtaining respective EC50 values (median effective concentration) equal to (0,53 ± 0,09) mM; (8,0 ± 0,5).10-3 mM; (1,7 ± 0,3) mM e (0,34 ± 0,04) mM. Meanwhile, in parallel experiments, the spectrophotometric quantification of phenols in culture media indicated that they are evenly diffused through agar. In this case, the EC50 values would be divided by 6, in order to consider the dilution of compounds by the media. The toxicity bioassay with N. gardneri species has advantages, manly in relation to the reproducible behavior of light emission, high intensity of bioluminescence, rapid growth of mycelium and sensitivity to the tested toxic agents. Considering these characteristics, the developed methodology represents a viable procedure for a toxicological bioassay. Accordingly, it can be improved in future work and performed in addition to other methods already developed for other terrestrial or aquatic organisms.

Os solos brasileiros são predominantemente ácidos, ocorrência comum nas regiões tropicais. Esta condição, aliada a outros fatores abióticos e bióticos, pode resultar em toxicidade de manganês (Mn) às plantas, o que limita o seu desenvolvimento. A utilização de práticas agrícolas convencionais propicia o aumento da toxidez de Mn, à medida que reduz o teor de matéria orgânica. Para atenuar este problema, algumas práticas como a calagem e o melhoramento genético são amplamente utilizados. Entretanto, a utilização de alternativas de manejo da cultura através do uso da simbiose micorrízica, para induzir maior resistência das plantas a altos níveis de Mn, parece bastante promissora. Para investigar possíveis mecanismos de indução da resistência e interações de nutrientes no controle da toxicidade de Mn em soja, foram avaliados o crescimento, a absorção e a acumulação de Mn, Fe, P e Ca e a atividade de catalase, peroxidase, superóxido dismutase e oxidase de AIA, nas folhas e raízes das plantas micorrizadas e não micorrizadas, além do nível de colonização de raízes pelo fungo micorrízico arbuscular (FMA). A planta teste foi a soja (Glycine max L. Merr. CV. IAC 8-2). O experimento foi executado em casa de vegetação, em vasos preenchidos com 4 Kg de solo classificado como Neossolo Quartzarênico típico, previamente autoclavado para eliminar fungos micorrízicos arbusculares. O delineamento foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial, 4x5: dois isolados de FMA, Glomus etunicatum e Glomus macrocarpum, cada qual com 30 mg kg –1 de P adicionado ao substrato e dois controles não inoculados, sendo um com 30 mg kg –1 e outro com 50 mg kg –1 de P, 5 níveis de Mn (0, 5, 10, 20, 40 mg kg -1 ). Foram realizadas duas épocas distintas de colheita, aos 45 e 90 dias. As atividades enzimáticas foram avaliadas pelo método PAGE não-denaturante através de análise visual. Os resultados demonstram que níveis de Mn entre 10 e 40 mg kg -1 no substrato podem induzir respostas de toxidez de Mn em plantas de soja, acompanhadas de redução de crescimento e alterações no padrão de absorção de vários nutrientes vegetais. O aumento da dose de P e a presença da micorriza são fatores de atenuação da toxidez de Mn em soja, visto que plantas micorrizadas contêm menor concentração de Mn em seus tecidos e, de uma maneira geral, menor atividade enzimática de peroxidase (PO) e oxidase do ácido-indolacético (AIA) do que as plantas controles. Aumentos no nível de Mn do substrato podem causar um aumento da atividade de PO e de oxidase de AIA nas plantas, sendo que as plantas mais estressadas quase sempre apresentam maior atividade dessas enzimas. Apesar da superóxido dismutase (SOD) ser também enzima antioxidativa, apresenta um padrão eletroforético diferenciado da PO, sendo que na raiz sua maior atividade está correlacionada com a presença do FMA. / Brazilian soils are predominantly acid, which is considered a common incident in tropical regions. Soil acidity in combination with biotic and non-biotic factors can result manganese toxicity in plants, limiting their development. The use of conventional agricultural practices promotes an increase in Mn toxicity, as it reduces the soil content of organic matter. This problem can be minimized by the use of some tilling practicies like liming and breeding, which are widely used. However, crop management alternatives through the use of mycorrhizae to induce greater Mn tolerance in plants under high levels of Mn seem to be promising. In this work, plant growth, the absorption, distibution of Mn, Fe, P, Ca and activity of catalase, peroxidase, superoxide dismutase and indolacetic acid oxidase were evaluated in leaves and roots of plants inoculated with mycorrhizal fungi and non-inoculated ones, to invetigate a possible resistance induction mechanism and nutrient interactions in control of toxic levels of Mn. A greenhouse experiment was conducted with soybean plant (Glycine max L. Merr. CV. IAC 8-2) in a completely randomized factorial design 4x5: inoculation of two different arbuscular mycorrhizal fungi (AMF): Glomus etunicatum and Glomus macrocarpum, which received 30 mg kg –1 of P, and two non-inoculated controls, one that received 30 mg kg –1 and the other with 50 mg kg –1 of P; 5 levels of Mn (0, 5, 10, 20, 40 mg kg -1 ). There were two harvest periods, 45 and 90 days. The enzymatic activities were evaluated in non-denaturing polyacrilamyde gel eletrophoresis (PAGE). Manganese levels between 10 and 40 mg kg -1 in the substrate can induce Mn toxicity in soybean plants, that results in a growth reduction and in alterations in the nuttrient absorption alterations of the plants. The increase of P and the presence of mycorrhizae result in the alleviation of Mn toxicity in soybean plants. Micorrhizal plants present lower Mn concentration and generally less enzymatic activity of indolacetic acid oxidase and peroxidase than control plants. Although both, peroxidase and superoxide dismutase are antioxidant enzymes, they present differentiated electrophoretic standards. Most of the time peroxidase and indolacetic acid oxidase activities increase due to increasing Mn levels. Superoxide dismutase activity, however, is higher in the shoots of micorrhizal plants when compared to control plants.