The aim of this study was to design a resolution typing system for the HLA-B gene. This technique involves a one-step PCR reaction utilizing genomic DNA and sequence-specific primers to determine the specificity of each allele and to produce a larger primer data base ideal for serological analysis. The application of this technique to serological analysis can improve serology detection which is currently hindered by antibody cross-reactivity and the unavailability of useful typing reagents.

Two species of Cryptosporidium are routinely found in pigs: Cryptosporidium suis and Cryptosporidium pig genotype II. Identification of Cryptosporidium species and genotypes currently relies on molecular methods such as polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction fragment lenght polymorphism (RFLP) or gene sequencing. However their applications are limited in identification of mixed infections. To overcome this problem, novel species specific primers were developed in this study. A total of 457 pig fecal samples were collected and examined using microscopy and molecular tools including PCR-RFLP, species or genus specific nested PCR and sequencing. Of these, 12.8 % were microscopicaly positive for oocysts presence and 36.5 % using molecular methods. While PCR-RFLP with genus specific primers revealed 1 case of C. suis and Cryptosporidium pig genotype II mixed infection only, nested PCR with species specific primers identified 41 cases of mixed infections. Our results showed that C. suis is infectious for all age categories of pigs and Cryptosporidium pig genotype II has been found in animals older than 6 weeks of age. Morphometric analysis proved oocyst size difference between both pig specific Cryptosporidium spp. Histological examination revealed that Cryptosporidium pig genotype II infects epithelia of both small and large intestine.

Polimorfismos do tipo indel são os mais abundantes depois dos SNPs, representando 3,6 milhões das variantes caracterizadas pelo projeto 1000 Genomes. Com uma distribuição que pode ser estimada em mais de um indel a cada 1000 pb, são facilmente encontrados em regiões de interesse. A baixa taxa de mutação e a possibilidade de desenhar primers alelo-específicos são as principais características dos indels que os diferenciam de STRs. O uso de primers aleloespecíficos na detecção e dosagem de misturas de DNA apresenta maior sensibilidade e acurácia que as técnicas usualmente empregadas. Aqui foram descritos, para 10 lócus indel, pares de primers flanqueadores e alelo-específicos para ambos os alelos (inserção e deleção) e foi realizado o estudo populacional em 160 indivíduos. A determinação de fenótipos e avaliação de especificidade dos primers, dos quais 28 foram específicos, foi realizada por PCR convencional seguida de PAGE. As análises populacionais e forenses mostraram que esses lócus apresentam alta variabilidade (heterozigose de 30-50%) e consequentemente, alta informatividade. Os valores de PIC, PE e PD variaram de 0,2763 a 0,3750; 0,1381 a 0,1875 e 0,4978 a 0,6250 respectivamente. Os valores cumulativos de PCE e PCD foram respectivamente 0,8508 e 0,9999. Assim, esse conjunto de indels é indicado para serem testados na detecção e quantificação de misturas de DNA a partir da amplificação alelo-específica. / Indels polymorphisms are the most abundant after SNPs, representing 3.6 million of the variants characterized by the 1000 Genomes project. With a distribution that can be estimated at more than one indel per 1000 bp, they are easily found in regions of interest. The low mutation rate and the possibility of designing allele-specific primers are the main characteristics of the indels that differentiate them from STRs. The use of allele-specific primers in the detection and dosage of DNA mixtures is more sensitive and accurate than regularly employed techniques. Here, for 10 indel loci, pairs of flanking primers and allele-specific primers, for both alleles (insertion and deletion), were described and a population study was performed on 160 individuals. Determining phenotypes and evaluation of primers specificity, of which 28 were specific, was performed by conventional PCR followed by PAGE. In population and forensic analysis, these loci showed high variability (heterozygosis of 30-50%) and consequently high informativeness. The values of PIC, PE and PD ranged from 0.2763 to 0.3750, 0.1381 to 0.1875 and 0.49978 to 0.6250 respectively. Combined values of PCE and PCD were respectively 0.8508 and 0.9999. Thus, this set of indels is indicated to be tested for detection and quantification of DNA mixtures using the allele-specific amplification method.

Xanthomonas citri subsp. malvacearum é o agente causal da mancha angular do algodoeiro, uma importante doença reportada em áreas de produção no Brasil e em todo o mundo. A partir da análise comparativa de sequências parciais do gene rpoB de linhagens de X. citri subsp. malvacearum, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. axonopodis e X. citri subsp. citri, desenhou-se o par de primers xam1R/2R. Foram testadas 19 espécies pertencentes ao gênero Xanthomonas, além de bactérias dos gêneros Acidovorax, Burkholderia, Erwinia, Pseudomonas e Ralstonia, e o produto de PCR específico de aproximadamente 560 pares de bases foi observado apenas para linhagens de X. citri subsp. malvacearum. Os primers desenhados mostraram-se altamente sensíveis, apresentando níveis de detecção de 8 ufc/ 5,0 L para suspensões da cultura pura da bactéria e 1,0 ng de DNA genômico de X. citri subsp. malvacearum. No isolamento, a partir de amostras de sementes sabidamente contaminadas, foram obtidas colônias bacterianas com características de morfologia e coloração semelhantes à X. citri subsp. malvacearum. Esses isolados foram submetidos a testes de coloração de Gram, hidrólise de amido, reação de hipersensibilidade (HR) em folhas de fumo e tomateiro, testes de patogenicidade em plantas de algodoeiro, amplificação com os primers específicos desenhados e sequenciamento do fragmento obtido e os resultados obtidos confirmaram a identificação dos mesmos como X. citri subsp. malvacearum. Experimentos combinados de BIO-PCR/nested-PCR foram realizados a partir do material obtido do processo de extração do patógeno das sementes contaminadas utilizando-se na primeira etapa de amplificação os primers correspondentes à parte do gene rpoB e na segunda etapa o produto da primeira amplificação e os primers específicos xam1F/2R. O resultado foi a observação de uma banda de aproximadamente 560 pb correspondente ao fragmento específico de X. citri subsp. malvacearum para todas as amostras testadas. Neste trabalho foi desenvolvido um teste de PCR específico para a detecção e identificação rápida e precisa dessa bactéria em amostras de sementes de algodoeiro. / Xanthomonas citri subsp. malvacearum is the causal agent of angular leaf spot of cotton an important disease reported in production areas in Brazil and worldwide. From the comparative analysis of partial rpoB gene sequences of X. citri subsp. malvacearum, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. axonopodis and X. citri subsp. citri strains, the pair of primers xam1F/2R was designed. Nineteen species of the genus Xanthomonas and isolates of the genera Acidovorax, Burkholderia, Erwinia, Pseudomonas and Ralstonia were tested and the specific PCR product of about 560 base pairs was observed only for strains of X. citri subsp. malvacearum. The primers were highly sensitive, with detection levels of 8 cfu/ 5.0 L for suspensions of pure culture of bacteria and 1.0 ng of genomic DNA of X. citri subsp. malvacearum. From contaminated seed samples, bacterial colonies were obtained with characteristic morphology and coloration similar to X. citri subsp. malvacearum. These isolates were tested for Gram stain, starch hydrolysis, hypersensitivity reaction (HR) on tobacco and tomato leaves, pathogenicity tests on cotton plants, amplification with the specific primers designed and sequencing of the fragment obtained. The results confirmed their identification as X. citri subsp. malvacearum. PCR experiments in combination of BIOPCR/ nested-PCR were performed with the material obtained from the extraction process of pathogen from seeds using in the first step of amplification primers corresponding to part of the rpoB gene and the second step the product of the first amplification and the specific primers xam1F/2R. The result was a band of approximately 560 bp corresponding to the specific fragment of X. citri subsp. malvacearum for all samples tested. In this work, a PCR test for the quick detection and accurate identification of this bacterium in seed samples of cotton were developed.

Xanthomonas citri subsp. malvacearum é o agente causal da mancha angular do algodoeiro, uma importante doença reportada em áreas de produção no Brasil e em todo o mundo. A partir da análise comparativa de sequências parciais do gene rpoB de linhagens de X. citri subsp. malvacearum, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. axonopodis e X. citri subsp. citri, desenhou-se o par de primers xam1R/2R. Foram testadas 19 espécies pertencentes ao gênero Xanthomonas, além de bactérias dos gêneros Acidovorax, Burkholderia, Erwinia, Pseudomonas e Ralstonia, e o produto de PCR específico de aproximadamente 560 pares de bases foi observado apenas para linhagens de X. citri subsp. malvacearum. Os primers desenhados mostraram-se altamente sensíveis, apresentando níveis de detecção de 8 ufc/ 5,0 L para suspensões da cultura pura da bactéria e 1,0 ng de DNA genômico de X. citri subsp. malvacearum. No isolamento, a partir de amostras de sementes sabidamente contaminadas, foram obtidas colônias bacterianas com características de morfologia e coloração semelhantes à X. citri subsp. malvacearum. Esses isolados foram submetidos a testes de coloração de Gram, hidrólise de amido, reação de hipersensibilidade (HR) em folhas de fumo e tomateiro, testes de patogenicidade em plantas de algodoeiro, amplificação com os primers específicos desenhados e sequenciamento do fragmento obtido e os resultados obtidos confirmaram a identificação dos mesmos como X. citri subsp. malvacearum. Experimentos combinados de BIO-PCR/nested-PCR foram realizados a partir do material obtido do processo de extração do patógeno das sementes contaminadas utilizando-se na primeira etapa de amplificação os primers correspondentes à parte do gene rpoB e na segunda etapa o produto da primeira amplificação e os primers específicos xam1F/2R. O resultado foi a observação de uma banda de aproximadamente 560 pb correspondente ao fragmento específico de X. citri subsp. malvacearum para todas as amostras testadas. Neste trabalho foi desenvolvido um teste de PCR específico para a detecção e identificação rápida e precisa dessa bactéria em amostras de sementes de algodoeiro. / Xanthomonas citri subsp. malvacearum is the causal agent of angular leaf spot of cotton an important disease reported in production areas in Brazil and worldwide. From the comparative analysis of partial rpoB gene sequences of X. citri subsp. malvacearum, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. axonopodis and X. citri subsp. citri strains, the pair of primers xam1F/2R was designed. Nineteen species of the genus Xanthomonas and isolates of the genera Acidovorax, Burkholderia, Erwinia, Pseudomonas and Ralstonia were tested and the specific PCR product of about 560 base pairs was observed only for strains of X. citri subsp. malvacearum. The primers were highly sensitive, with detection levels of 8 cfu/ 5.0 L for suspensions of pure culture of bacteria and 1.0 ng of genomic DNA of X. citri subsp. malvacearum. From contaminated seed samples, bacterial colonies were obtained with characteristic morphology and coloration similar to X. citri subsp. malvacearum. These isolates were tested for Gram stain, starch hydrolysis, hypersensitivity reaction (HR) on tobacco and tomato leaves, pathogenicity tests on cotton plants, amplification with the specific primers designed and sequencing of the fragment obtained. The results confirmed their identification as X. citri subsp. malvacearum. PCR experiments in combination of BIOPCR/ nested-PCR were performed with the material obtained from the extraction process of pathogen from seeds using in the first step of amplification primers corresponding to part of the rpoB gene and the second step the product of the first amplification and the specific primers xam1F/2R. The result was a band of approximately 560 bp corresponding to the specific fragment of X. citri subsp. malvacearum for all samples tested. In this work, a PCR test for the quick detection and accurate identification of this bacterium in seed samples of cotton were developed.

Green algae are quite important primary producers in fresh waters. The genus Chlorella represents one of algae most frequently utilized in algal biotechnologies to produce biomass, using either autotrophic or heterotrophic cultivation systems. It is than exploited as a food supplement for humans or animals. However, particular species within the genus are morphologically indistinguishable and molecular markers should be used to characterize production strains. This work is aimed to molecularly characterize three production strains of Chlorella for patent protection purposes and to specify their phylogenetic and taxonomic position.