1 |
Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidisLössner, Isabel. January 2002 (has links) (PDF)
Würzburg, Universiẗat, Diss., 2002.
|
2 |
Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256-TransposaseHennig, Susanne. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2006--Würzburg.
|
3 |
Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256 Transposase / Modulation of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and functional characterization of IS256 transposaseHennig, Susanne January 2006 (has links) (PDF)
Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue ökologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der Fähigkeit, Biofilme auf abiotischen Oberflächen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilität. Ein markantes Beispiel für genotypische Variabilität ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und präzise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON“ Mechanismus der Phasenvariation, die präzise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabhängigen Prozess vollständig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Präzise Exzision war hingegen abhängig von der Integrität der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte präzise Exzision Transposase-unabhängig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision für die vollständige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verkürzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war präzise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verkürzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der präzisen Exzision ca. dreifach erhöht. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionshäufigkeit im Ungleichgewicht stehen. Während der Durchführung der Experimente zur präzisen Exzision aus icaC wurden nach mehrtägiger Passage häufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Phänotyp als der Wildtyp auf. Anstelle von fädiger extrazellulärer Substanz wie beim Wildtyp wurde verstärkt eine polymorphe, aus globulären Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 % NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollständig, während es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 % Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich stärkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erhöhten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis über einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verfügt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung führen kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro näher charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog überexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erhöhte Affinität zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verkürzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Domäne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminosäuren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA überprüft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen führten zu einer stark abgeschwächten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsvermögens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdomäne eines Elements der IS256-Familie näher beschrieben. / During the past decades, Staphylococci, especially Staphylococcus aureus and the coagulase-negative Staphylococcus epidermidis, have been established as a predominant cause of nosocomial infections. This remarkable adaptation to a new ecological niche by S. epidermidis is due to three main factors: (i) the ability to colonize abiotic surfaces as biofilms, (ii) the acquisition of multiple resistances to antibiotics and (iii) a high genotypic and phenotypic variability. A prominent example of genotypic and phenotypic variability is phase variation in biofilm formation caused by insertion and excision of the insertion sequence IS256 within the ica operon. In the first part of this thesis, the mechanism of “OFF-ON” transition, caused by precise excision of IS256 from the ica operon, was studied. It was demonstrated that IS256 including the duplicated 8 bp target site is excised completely from the chromosome in a transposase-independent manner, neither accompanied by chromosomal rearrangements nor new insertions. However, precise excision depended on the integrity of the target site duplications. Even after insertion of IS256 onto a plasmid (spc::IS256) transposase-independent precise excision was detected. The probability of this event was calculated to be 1x10-11 per cell generation. After shortage of the microhomology between the 8 bp target site duplications to 6 bp or less, precise excision was not detectable any longer. Deletion of the transposase gene, leading to a 160 bp IS256 fragment still harbouring complete inverted repeats and flanked by intact target site duplications, enhanced the probability of precise excision about threefold. These observations support the hypothesis that precise excision is caused by the illegitimate recombination process of replicational slippage. Furthermore, the data indicate an imbalance between insertion and excision of IS256 within the phase variation process. When studying precise excision from icaC, strong biofilm producing variants still carrying the icaC::IS256 insertion were isolated frequently after several days of passaging. Such biofilm-positive, PIA-negative variants showed a phenotype different from the wild type as displayed by Atomic force microscopy. Instead of a fibrous extracellular substance as in the wild type, the variants produced a polymorphous matrix formed by more or less globular substructures. In contrast to the wild type growing in a polysaccharide-mediated biofilm, the alternative biofilm´s extracellular matrix consisted of proteins. Regulation of proteinaceous biofilm formation differed compared to PIA-dependent biofilm. Addition of 4 % sodium chloride abolished proteinaceous biofilm formation completely, while it induced biofilm formation in the wild type. Addition of 3 % ethanol caused a considerably stronger induction of biofilm formation compared to the wild type. The transcript level of accumulation associated protein, aap, was enhanced in comparison to the wild type; an observation that was also confirmed at the protein level. Taken together, these data indicate that S. epidermidis is capable of switching to an alternative mode of biofilm formation, thus possibly modulating the previously described phase variation by IS256 insertion and excision. In the third part of this thesis, specific binding of IS256 transposase was characterized in vitro. To this end, IS256 transposase was overexpressed heterologously and purified using an N-terminal calmodulin binding tag (CBP). In electrophoretic mobility shift assays (EMSA) CBP-transposase bound to IRL and IRR containing DNA fragments specifically, albeit with slightly higher affinity to IRR. Binding of CBP-transposase to the inverted repeats within circle junction DNA as well as unspecific end binding could be confirmed by Atomic force microscopy. Deletions within the sequence of the right or left inverted repeat revealed that CBP-transposase binds to the inner part of the inverted repeats. EMSA experiments with truncated transposase derivatives suggested a DNA binding motif within the N-terminal domain of the transposase. The identified protein region (amino acid 100 – 130) consists of two a-helices separated by a short turn, displaying typical features of a helix-turn-helix motif. Six conserved amino acid residues within this putative motif were exchanged by point mutations and the effect of the mutation was tested in EMSA. Exchange of L103 and L127 against the helix-breaking amino acid proline had no detectable effect on DNA binding. However, exchange Y111A, G114W, T117A and R118A strongly reduced or completely abolished DNA binding. This is the first description of a DNA binding domain of a member of the IS256 family.
|
4 |
Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermdis / The role of the bacterial insertion sequence IS256 in the modulation of biofilmproduction in Staphylococcus epidermidisLößner, Isabel January 2002 (has links) (PDF)
Staphylococcus epidermidis zählt zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdkörpern. Diese Bakterien zeigen eine außergewöhnliche phänotypische und genotypische Variabilität, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. Möglicherweise verfügen Staphylokokken damit über Anpassungsstrategien, die sie für das Überleben unter wechselnden Umweltbedingungen benötigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizität von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die Fähigkeit von S. epidermidis, an Oberflächen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Präsenz und Expression des ica-Operons abhängig, das Enzyme für die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist äußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die veränderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zurückzuführen ist, an denen das IS-Element IS256 ursächlich beteiligt ist. Zunächst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die nähere Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abkömmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache für den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot für die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis Stämmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache für die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der Fähigkeit, Biofilme auszubilden, führte. Um die Frage zu klären, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis –Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verfügung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-Stämmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster für Proteine mit Ähnlichkeiten zu oberflächenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adhärenz der Bakterien beteiligt sein könnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit Ähnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis möglicherweise Teil einer Pathogenitätsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizität von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufklärung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkulärer, extrachromosomaler DNA-Moleküle gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollständigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Brücke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der früheren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollständigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Moleküle gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen können und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion während der Zirkularisierung mit geringer Spezifität verläuft. Ringförmige IS256-Moleküle konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-Stämmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen läßt. Dagegen konnte durch die Einführung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt für die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkulärer IS256-Moleküle die Voraussetzung für die präzise Exzision des Elementes während der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zurücklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen während der Zirkelbildung vorstellbar. Darüber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte für homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor für die Flexibilität des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, könnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben. / Staphylococcus epidermidis is the predominant cause of implanted medical device related infections and of nosokomial sepsis. These bacteria show an unusual phenotypic and genotypic variability that comprises the expression of virulence- and resistance-associated genes. This adaptability is thought to be involved in the survival of staphylococci under changing environmental conditions. In this study the role of bacterial insertion sequences (IS) in the genome plasticity of S. epidermidis was investigated. Of particular interest was the insertion sequence element IS256 and its influence on S. epidermidis-biofilm formation. The capability of S. epidermidis to attach to surfaces and to form biofilms is due to the presence and expression of the ica Operon. This gene locus was shown to mediate cell-cell adhesion and production of the polysaccharid intercellular adhesin (PIA). The PIA-production is variable and has an influence on the virulence and staphylococcal colonization. In the first part of this work it was shown that variable PIA-production depends on three different mechanisms which involve the insertion sequence IS256. By comparison of different IS256-specific hybridization patterns of a biofilm forming wildtype S. epidermidis and its PIA-negative spontaneous variants, it could be shown that IS256 which is present in multiple copies in the genome of this strain is highly active. A more detailed analysis of this variants has shown that IS256 mediates genome rearrangements and causes the loss of biofilm formation in a number of PIA-negative variants. Another group of biofilm-negative variants carries an IS256 inserted in the ica-Operon. The distribution of the icaC::IS256 insertion sites led us assume that icaC is a hot spot for the integration of IS256. ica::IS256 insertions have been detected in numerous S. epidermidis strains. Because this insertions are reversible they are a substantial cause for phase variation of biofilm formation in S. epidermidis. A third group of variants shows the deletion of chromosomal DNA fragments of variable length which are accompanied with the loss of the ica genes and the ability to form biofilms. To answer the question which are the ica-neighbouring genes that get lost with the deletion of DNA-Fragments up to 250 kbp, we constructed an S. epidermidis wild type cosmid library. Nucleotide sequence information has been compared with the sequence of the reference strain S. epidermidis RP62A that is available in the genome database and was summarized in a gene map. Apart from some differences between this two S. epidermidis strains, it was remarkable that various open reading frames get lost, which show similarities to surface-associated proteins and which might be involved in adherence of bacteria. In addition, there are open reading frames showing similarities to transport proteins and numerous mobile DNA elements. These results indicate that the ica operon could be possibly a part of a pathogenicity island. Analysis of the deletion borders of a mutant has shown that homologous 1. B SUMMARY 4 recombination between two IS256 elements, oriented in the same direction, were responsible for the loss of more than 200 kbp DNA. Because IS256 plays an essential role in the genome plasticity in S. epidermidis it was of special interest to elucidate the transposition mechanism of IS256 which was the second part of this work. The data obtained in this analyses have shown that IS256 transposes via an alternative transposition mechanism that is characterized by the formation of extrachromosomal circular DNA molecules. These DNA circles consist of complete IS256 copies in which the left and the right end of the IS element are connected via foreign DNA (circle junctions). It could be shown that these circle junctions were derived from upstream and downstream flanking DNA-sequences of the parental genetic locus. In addition to complete circles, incomplete circles were detected in which either the left or the right end of IS256 was truncated. These results suggest that either end of IS256 can attack the opposite terminus and, in contrast to other circle-forming IS elements, the strand-transfer reaction occurs with low specifity. Circular IS256 molecules could be shown both in recombinant S. aureus and E. coli strains, which indicates that in the circularization process host factors play a minor role. Mutagenesis of the gene for the putative transposase revealed that this gene product is essential for formation of IS256 circles. There are grounds for the assumption that the formation of IS256-circles is the prerequisite for precise excision of the element during biofilm phase variation. Besides the generation of stable mutations through imprecise excision of the element is conceivable. In addition multiple copies of the element in the genome represent sites for homologous recombination. The combined data suggest that IS256 represents a driving force in the flexibility of the S. epidermidis genome. A detailed analysis of the molecular mechanisms which influence the transposition of IS256 could give an insight into the genetic adaptation of this important nosocomial pathogen.
|
5 |
Studies on the mechanism of staphylococcal conjugation /Von David, William J. January 1998 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1998. / "December 1998." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves [89]-98). Also available on the Internet.
|
6 |
Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus / Epidemiological and molecular investigations of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureusCho, Seung-Hak January 2001 (has links) (PDF)
Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht. / Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly biofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression.
|
7 |
Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureusCho, Seung-Hak. January 2001 (has links) (PDF)
Würzburg, Univ., Diss., 2002.
|
8 |
Infections ostéo-articulaires à Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis : épidémiologie moléculaire et corrélation entre expression clinique et interactions hôte – bactérie / Pas de titre anglaisValour, Florent 15 December 2014 (has links)
Le genre Staphylococcus, première étiologie des infections ostéo-articulaires (IOA), est associé à des formes particulièrement difficiles à traiter. Trois mécanismes phénotypiques ont été rattachés à ce fort taux de chronicité et de rechutes, permettant l'adaptation bactérienne à la vie au sein du tissu osseux et un échappement au système immunitaire de l'hôte et à l'action des antibiotiques : la formation de biofilm, la persistance des staphylocoques dans les ostéoblastes, et l'évolution vers le morphotype de small colony variant (SCV). Longtemps considéré comme simple commensal cutanéo-muqueux, S. epidermidis est désormais reconnu comme un agent étiologique majeur des IOA sur matériel. Or, si le portage est universel, l'infection est un phénomène rare. A ce jour, aucun facteur génotypique n'a pu être associé au pouvoir invasif de certaines souches de portage. Notre travail a permis de montrer l'absence de pouvoir discriminant des capacités d'internalisation des ostéoblastes et de formation de biofilm entre souches commensales et invasives. Par ailleurs, un très faible taux d'internalisation de S. epidermidis dans les ostéoblastes a été mis en évidence, suggérant une importance moindre de ce mécanisme dans la physiopathologie des IOA à S. epidermidis par rapport aux IOA à S. aureus. Les principales études ayant porté sur les capacités d'interaction de S. aureus avec les ostéoblastes et de formation de biofilm ont cherché à en explorer les mécanismes à partir de souches de laboratoire ou de souches représentatives de quelques clones de S. aureus résistants à la méticilline (SARM). Dans notre cas, nous avons souhaité étudier une large collection de souches cliniques de S. aureus (n=95) sensible à la méticilline (SASM) responsables d'IOA aiguës ou chroniques. La caractérisation des fonds génétiques de cette collection, puis en élargissant notre étude à des collections de différents villes françaises, a d'abord permis de décrire une forte prévalence du clone émergent de SASM CC398 dans les IOA en France / Pas de résumé en anglais
|
9 |
Analyse einer chromosomalen Deletion und Entdeckung einer neuartigen nicht-translatierten RNA in Staphylococcus epidermidis / Analysis of a chromosomal deletion and discovery of a novel non-translated RNA in Staphylococcus epidermidisEckart, Martin January 2006 (has links) (PDF)
Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der häufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die Fähigkeit, auf künstlichen Oberflächen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilität und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgelöst wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das überraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der Nähe des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verkürzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer Stämme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollständiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene Stämme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen Nähe auch die Insertionsstelle für die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilität darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen Stämmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabwärts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gestützt auf bioinformatische Analysen wurden zunächst die Polarität und Länge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise überlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen größeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 –Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen phänotypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon für zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilität ist, die sich hauptsächlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und für die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer über Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir für die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit höherem Virulenzpotential übertragen werden können und so einen wichtigen Faktor für die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit möglicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der – abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs – bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken eröffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verständnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann. / Staphylococcus epidermidis is an important part of the human skin flora, but also the most frequent cause of nosocomial infections in immune-suppressed patients. Research in the last years focused on the factors and mechanisms leading to the establishment of the species as a pathogen. A typical feature of clinical isolates of S. epidermidis is the ability to form biofilms on artificial surfaces. Topic of this work was the IS-mediated genome flexibility and the comparison of genome structure from nosocomial and commensal S. epidermidis isolates. A 260 kb large spontaneous deletion in the chromosome of the biofilm-forming strain S. epidermidis 307 was sequenced and annotated. The deletion was caused by homologous recombination of two IS256 copies. It contained many putative virulence-associated genes besides the ica operon. However, the surprising result of this analysis was the identification of a new SCC element that limits the right border of the deletion. This is the first report of a SCC element containing a CcrC recombinase but lacking the mecA gene. DNA of S. haemolyticus is located near the recombinase gene ccrC. Further studies showed that the SCC element is truncated due to IS256/Tn4001 mediated deletion in the mutant. Genome comparison of ica-positive and ica-negative S. epidermidis strains using microarrays revealed that commensal and pathogenic strains differ only in very few factors. This was confirmed by in silico comparison of two complete genomes of S. epidermidis. Most of the virulence factors are harbored within a region around the oriC. The insertion sites of the SCCmec islands and the deleted fragment of S. epidermidis are also located in this part of the genome, that obviously represents a region of high genomic flexibility and in which foreign DNA can be integrated. Furthermore, this work showed that the ica operon delimits this variable segment of the genome. The exact border between ica-positive and ica-negative strains represents a Thr-tRNA within the 1.4 kb intergenic region downstream of the icaR regulatory gene. In the direct vicinity a transcript could be detected that is only present in ica-positive S. epidermidis. Based on bioinformatical analysis the polarity, length, and the corresponding promoter were experimentally determined. The RNA ranges 487 nt in length and overlaps partly with the Thr-tRNA on the opposite strand. Neither a ribosomal binding site nor an appropriate open reading frame can be found; so, it is likely that the RNA is not translated. Qualitative RT-PCR experiments showed constitutive expression of the IGRica-RNA. Spontaneous IS256 insertion mutants within the promoter region of the IGRica-RNA exhibited a clearly diminished biofilm formation. Therefore, it is tempting to speculate that the IGRica-RNA is involved in the regulation of this important virulence factor. The experiments show that S. epidermidis also expresses the highly conserved Hfq protein that functions as a binding partner and a chaperon for many regulatory RNAs. However, gel shift experiments with recombinant Hfq from S. epidermidis revealed no detectable interaction of the IGRica-RNA with this factor in vitro. In summary, the study shows that S. epidermidis is a species with extraordinary high genome flexibility in a certain region of the genome where IS elements have a special influence. Identification of DNA from other staphylococcal species demonstrates that S. epidermidis is capable of horizontal gene transfer beyond the species barrier. This and the newly discovered SCC element emphasize the importance of S. epidermidis as a reservoir for the development of new resistance and virulence determinants. These factors can be transferred easily within the hospital environment to species with a higher virulence potential. This represents an important factor for the long-standing problem of nosocomial infections with S. aureus. The discovered RNA with a putative regulatory function is the first factor of this kind that has been identified in S. epidermidis so far, besides some phylogenetically conserved RNAs. Functional analysis of the IGRica-RNA and investigation for other regulatory RNAs in staphylococci open a wide field of research that can contribute considerably to the understanding of these important pathogens.
|
10 |
Studies on the mechanism of staphylococcal conjugationVon David, William J. January 1998 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1998. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves: [89]-98). Also available on the Internet.
|
Page generated in 0.2819 seconds