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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El uso excesivo de antimicrobianos, debido a la intensificación de los sistemas productivos, ha producido un aumento en la resistencia bacteriana. Debido a esto, diferentes organizaciones intergubernamentales han solicitado el uso racional de estos fármacos en estos sistemas productivos. El mal uso de antimicrobianos se observa en diversas patologías, dentro de las cuales se encuentra la mastitis clínica del ganado lechero, cuyo principal agente etiológico en la zona sur del país es Staphylococcus aureus, resistente a múltiples fármacos. Por este motivo se han estudiado nuevas alternativas terapéuticas, como Aloe vera, por su efecto antimicrobiano. Se evaluaron los efectos inhibitorios de liofilizados de geles de A. vera comercial y extraído de plantas nacionales, asociados a cloxacilina o ceftiofur frente a S. aureus ATCC 29213 mediante el Método de Macrodilución en Caldo. Se determinó su Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante turbidez y se confirmó por UFC/mL y absorbancia. Los resultados obtenidos demostraron una disminución de un 87,5% y 75% en las CMI establecidas por el CLSI de ceftiofur y cloxacilina respectivamente. Estos resultados permitirían formular un tratamiento intramamario con esta asociación para las mastitis clínicas causadas por S. aureus. Esto disminuiría la posibilidad de generar resistencia, como también reduciría los periodos de carencia definidos actualmente para estos fármacos. / Proyecto Fondef IDeA 12I10008

Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimhäute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenitätsfaktoren, aber auch durch seine Fähigkeit, Biofilme auf künstlichen Oberflächen wie Kathetern und Implantaten formen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenität von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator für die Sekretion von extrazellulären Proteinen darstellt und darüber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminosäuren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verknüpfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele stationäre-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses führt zu einem stark veränderten Phänotyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazität, der Biofilmbildung, der Invasivität und dem Langzeitüberleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 % der klinischen Isolate natürlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark veränderten Phänotyps und ihrer veränderten biochemischen Bedürfnisse und Kapazität in der Lage sind, andere ökologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es möglich, über die Einführung einer Biofilm-Adhäsion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und Stämme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der Nährstoffsituation abhängig ist, und dass verschiedene Stämme sehr unterschiedlich auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anfälliger für Strömungsscherkräfte, die dann ganze Bakterienverbände ablösen und zu neuen Infektionsherden schwemmen könnten. Somit ermöglicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umständen ein besseres klonales Überleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchläuft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivität und einer erhöhten Antibiotika-Resistenz führt. Darüber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenitätsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verständnis der Pathogenität und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage für weiterführende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Präventionsansätze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln. / The gram-positve, coagulase-negative bacterium Staphylococcus epidermidis was regarded as a harmless commensal of the human skin and mucosa. However, in the last two decades S. epidermidis has emerged as one of the major causes of nosocomial infections. In contrast to other infectious bacteria, S. epidermidis possesses only a limited number of pathogenicity factors, but forms a thick biofilm on artificial devices such as catheters and implants. This thesis deals with two main aspects of the pathogenicity of S. epidermidis: (i) the Quorum-sensing system Agr (accessory gene regulator) and (ii) the aspects of time dependency of biofilm formation and its regulatory mechanism. The Quorum-sensing system Agr is part of a complex network in Staphylococci. This work demonstrates that the Agr-System is the main regulator for the extracellular proteome. Moreover, it affects directly and indirectly the central metabolism and the biosynthesis of amino acids in S. epidermidis. By employing microarray and proteome analyses the pleiotrophic repressor CodY was identified as an important player which interacts with the Agr-system and influences staphylococcal metabolism. CodY is responsible for the repression of late stationary phase genes. Proteome and transcriptome analyses along the growth curve revealed that this effect occurs only in the S. epidermidis agr wild type, while the S. epidermidis agr mutant expresses late stationary phase genes right from the beginning of the exponential growth stage. This leads to a strongly altered phenotype of the S. epidermidis agr mutant concerning growth capacities, biofilm formation, invasion into host cells and long term survival. Interestingly, another study has shown recently that about 17 % of all clinical isolates are naturally occurring S. epidermidis agr mutants. This supports the hypothesis that S. epidermidis agr mutants are capable of clonizing alternative ecological niches by their strong altered biochemical and physiological properties. The main focus in the second part of this thesis aims at biofilm formation of S. epidermidis. In order to compare different conditions and strains for their biofilm capacity, a standardized protocol was established and a simple mathematical model was introduced. These investigations underlined that biofilm formation in S. epidermidis is a chronologically synchronized, but dynamic process which depends on environmental conditions and nutrition supply. In addition, different strains display variations in responsing to altered environmental conditions. Interestingly, S. epidermidis is not able to detach from a biofilm in form of single cells. s shown by confocal laser microscopy over a time course of 48 hours, bacteria rather die off in the inner zones of the biofilm. By this means, the structure gets instable and more susceptible to shearing forces resulting in detachment and drifting of bacterial clusters which are then transported to novel colonization sites. Therefore, death of a single cell might be an advantage for the clonal survival. This is in accordance with the data of gene expression analyses by microarrays. Moreover, these analyses show that biofilm formation in S. epidermidis is a strongly regulated process under very special physiological conditions. Obviously, biofilm formation leads to a diminished metabolic activity, a higher antibiotic resistant and to a diminished secretion of extracellular proteins and other immunogenic substances which supports the evasion of S. epidermidis from the host immune response. The results on regulation of biofilm formation and the function of the Agr system give interesting new insights into the pathogenicity and physiology of this important pathogen and its survival in the human host. The data provide an excellent theoretical basis for future experimental work aiming at the development of new therapeutic strategies against S. epidermidis infections.

Um Änderungen in seiner Umwelt wahrnehmen zu können, benötigt S. aureus unterschiedliche Signaltransduktionssysteme. In dieser Arbeit wurde erstmals die Eukaryoten-ähnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknB umfassend charakterisiert. Die posttranslationale Proteinmodifikation mittels Phosphorylierung spielt sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle. Man glaubte lange, dass die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten ein nur auf Eukaryoten beschränkter Regulationsmechanismus ist. Dagegen wurde die Phosphorylierung an Histidin- und Aspartatresten durch die Zweikomponenten-Systeme allein den Prokaryoten zugeordnet. Die Genomanalysen der letzten Jahre identifizierten jedoch STPKs und Serin/Threonin-Proteinphosphatasen (STPP) in nahezu allen prokaryotischen Genomen. Auch S. aureus codiert für eine STPK, die eine hohe Homologie zu den beschriebenen STPKs aufweist. In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Analyse einer ΔpknB-Mutante im Stamm 8325 erste Hinweise zur Funktion von PknB als Regulator der Zellwandsynthese sowie zentraler Stoffwechselwege gewonnen. Es wurden mittels Phosphopreoteom-Analysen in vivo-Substrate identifiziert und weiterhin die Kinase biochemisch charakterisiert. / S. aureus needs effective signal transduction systems to be able to sense a changing environment. In this work we characterize for the first time the regulatory ser/thr protein kinase PknB. The posttranslational protein modification via phosphorylation plays an important role in eukaryotes as well as in prokaryotes. The phosphorylation of proteins on serine, threonine, and tyrosine residues was originally thought to be a mechanism of signal sensing and translation only restricted to eukaryotes. In contrast, prokaryotes were thought to achieve signal transduction exclusively via the phosphorylation of histidine and aspartate residues by using two-component systems. However, recent bacterial genome sequencing identified STPKs and STPPs in almost all bacterial genomes. S. aureus also encodes a STPK, which shows high similarity to the described STPKs. In this study the putative function of PknB as a regulator of cell wall-synthesis as well as central metabolic pathways was analysed by a competitive microarray approach. Furthermore, a phosphoproteome analysis was used to identify in vivo substrates and a biochemical characterization was performed.

Staphylococcus aureus reagiert auf veränderte Umweltbedingungen wie Hitze, pH und Chemikalien mit Hilfe globaler Regulatoren wie dem Sae (S. aureus exoprotein expression) Zweikomponenten-System. Subinhibitorische Konzentrationen einiger Antibiotika können die Expression von Virulenzfaktoren erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Stressantwort von S. aureus auf subletale Konzentrationen des geläufigen Desinfektionsmittels Perform® untersucht. Dazu wurden biochemische Methoden wie SDS-PAGE und Massen-Spektrometrie sowie molekularbiologische Methoden wie qRT-PCR und Promotoraktivitäts-Assays eingesetzt. Davon abhängige, funktionelle Veränderungen wurden in durchfluss-zytometrischen Invasions-Assays analysiert. Perform wirkt durch die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Das Wachstum von S. aureus in Medien mit subletalen Konzentrationen von Perform verringerte in den Stämmen 6850, COL und ISP479C die Expression mehrerer Proteine, wohingegen im Stamm Newman eine gesteigerte Expression mehrerer Proteine festgestellt werden konnte. In der Literatur werden diese vermehrt exprimierten Proteine als sae-abhängig beschrieben. Der Effekt von Perform konnte durch das im Desinfektionsmittel enthaltene Detergenz SDS nachgeahmt werden, jedoch nicht durch Paraquat oder weitere Detergenzien wie Triton X-100 oder Tween 20. Eine Solubilisierungsreaktion durch die Detergenz-Wirkung konnte ausgeschlossen werden, da der beobachtete Effekt von lebenden Bakterien abhängt. Für Eap (extracellular adherence protein) konnte die deutlichste Steigerung der Proteinexpression festgestellt werden und eine Transkriptionsanalyse bestätigte die gesteigerte Eap-Expression. Die Promotoraktivität des sae Promotors P1 wurde sowohl durch Perform als auch durch SDS verstärkt. Die Anwesenheit von Perform und SDS hatte auch funktionelle Änderungen zur Folge: In durchflusszytometrischen Experimenten erhöhte sich beispielsweise die Invasivität auf das 2,5- bzw. 3,2-fache und die beobachteten Unterschiede konnten durch Lysostaphin Protektions Versuche bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die gesteigerte Invasivität in Stamm Newman von Eap und dem sae-System abhängig war, während agr, sarA, sigB und FnBPs keinen entscheidenden Einfluss auf die Invasivität hatten. In dieser Arbeit wurde außerdem aufgedeckt, dass die Besonderheit des Stammes Newman durch eine Mutation in saeS (Sensor-Histidinkinase) bedingt war. Obwohl postuliert wird, dass diese Punktmutation ein konstitutiv aktiviertes sae System zur Folge hat, konnte die hohe sae Aktivität durch Perform und SDS jedoch noch weiter gesteigert werden. Durch den Austausch des gesamten sae-Operons konnte gezeigt werden, dass sich der Stamm Newman saeISP479C wie der Stamm ISP479C, und der Stamm ISP479C saeNewman sich analog zu Stamm Newman verhielt. Zusammenfassend kann aus den vorliegenden Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass ein Aminosäurenaustausch in der Sensor-Histidinkinase SaeS des Stammes Newman verantwortlich für die gesteigerte Expression von Eap und die daraus resultierende gesteigerte Invasivität nach der Inkubation mit subletalen Konzentrationen von Perform und SDS ist. Diese Daten können dazu beitragen, die Virulenzmechanismen im Stamm Newman, speziell die Rolle des Sae-Systems, aber auch die der generellen Regulation, besser verstehen zu können. / Staphylococcus aureus copes with changing environmental conditions like heat, pH and chemicals by utilizing global regulators such as the Sae (S. aureus exoprotein expression) two-component signaling system. Subinhibitory concentrations of some antibiotics were shown to increase virulence factor expression. Here, we investigated the S. aureus stress response to sublethal concentrations of the commonly used biocide, Perform®. Therefore biochemical methods including SDS-PAGE and mass spectrometry as well as molecular biological methods like qRT-PCR and promoter activity assays, were used. Additionally, functional differences were analyzed by flow cytometric invasion assays. Perform, acting through the production of reactive oxygen species, generally downregulated the expression of extracellular proteins in strains 6850, COL, ISP479C, but upregulated these proteins in Newman. All upregulated proteins were sae-dependent. Whereas the Perform component SDS mimicked the biocide effect, paraquat or other detergents, as Triton X-100 or Tween 20 did not. A solubilisation by the detergents could be excluded due to the effect´s requirement of live bacteria. Eap (extracellular adherence protein) was most prominently augmented. Upregulation of eap was confirmed by qRT-PCR. Promoter activity of the sae promoter P1 was increased by Perform and SDS. Flow cytometric analysis revealed that both substances enhanced cellular invasiveness 2.5-fold and 3.2-fold, respectively, and the increased invasiveness could be validated by a lysostaphin protection assay. Furthermore, the increased invasiveness was dependent on Eap and the sae system, whereas agr, sarA, sigB and FnBPs had no major effect in strain Newman. This unique response pattern was due to a point mutation in SaeS, as demonstrated by allele swapping. Newman-saeSISP479C behaved like ISP479C, whereas saeSNewman rendered ISP479C equally responsive as Newman. The point mutation is said to lead to a constitutively active sae-system, but with Perform and SDS we were able to further enhance the already high sae-activity. Taken together, an amino acid-substitution in the sensor histidine kinase SaeS of strain Newman was shown to be responsible for the increased expression of Eap upon exposure to sublethal Perform and SDS concentrations, leading to increased Eap-dependent cellular invasiveness. These data may be important for a deeper understanding and further analyzing the virulence mechanism in strain Newman, especially the role of the sae-system but also the general regulation.

Biofilm production is an important step in the pathogenesis of S. epidermidis polymer-associated infections and depends on the expression of the icaADBC operon leading to the synthesis of a polysaccharide intercellular adhesin (PIA). The PIA represents a sugar polymer consisting of ß-1,6 linked N-acetyl glucosaminoglycans and mediates the intercellular adherence of the bacteria to each other and the accumulation of a multilayered biofilm. Epidemiological and experimental studies strongly suggest that PIA-production and subsequently biofilm formation contributes significantly to the virulence of specific S. epidermidis strains. This work aimed on the investigation of external factors regulating the ica expression in S. epidermidis. For this purpose, a reporter gene fusion between the ica promoter and the beta-galactosidase gene lacZ from E. coli was constructed and integrated into the chromosome of an ica positive S. epidermidis clinical isolate. The reporter gene fusion was used to investigate the influence of external factors and of sub-MICs of different antibiotics on the ica expression. It was shown that the S. epidermidis biofilm formation is growth phase dependent with a maximum expression in the late logarithmic and early stationary growth phase. The optimal expression was recorded at 42 °C at a neutral pH ranging from 7.0 to 7.5. The glucose content of the medium was found to be essential for biofilm formation, since concentrations of 1.5 to 2 per cent glucose induced the ica expression. In addition, external stress factors as high osmolarity (mediated by 3 to 5 per cent sodium chloride), and sub-lethal concentrations of detergents, ethanol, hydrogene peroxide, and urea significantly enhanced the biofilm production. Subinhibitory concentrations of tetracyline, the semisynthetic streptogramin quinupristin/dalfopristin and the streptogramin growth promoter virginiamycin were found to enhance the ica expression 8 to 11-fold, respectively, whereas penicillin, oxacillin, gentamicin, clindamycin, vancomycin, teicoplanin, ofloxacin, and chloramphenicol had no effects. A weak induction was recorded for sub-MICs of erythromycin. Both quinupristin/ dalfopristin and tetracyline exhibited a strong postexposure effect on the S. epidermidis ica expression, respectively, even when the substances were immediately removed from the growth medium. The results were confirmed by Northern blot analysis of the ica transcription and quantitative analysis of biofilm formation in a colorimetric assay. Expression of the icaprom::lacZ reporter gene plasmid in Bacillus subtilis and S. epidermidis revealed that the ica induction by sub-MICs of streptogramins and tetracycline might depend on unidentified regulatory elements which are specific for the staphylococcal cell. In contrast, the activation by external stress signals seems to be mediated by factors which are present both in Staphylococci and in Bacillus subtilis. Construction and analysis of an agr-mutant in a biofilm-forming S. epidermidis strain excluded the possibility that the Agr-quorum-sensing system significantly contributes to the ica expression in the stationary growth phase. However, clear evidence was provided that in S. aureus the ica transcription depends on the expression of the alternative transcription factor sigmaB, which represents a global regulator of the stress response in S. aureus as well as in B. subtilis. For this purpose, a sigB knockout mutant had been constructed in a biofilm-forming S. aureus. This mutant showed a markedly decrease of the ica transcription and biofilm-production, whereas a complement strain carrying the sigB gene on an expression vector completely restored the biofilm-forming phenotype of the S. aureus wild type. Southern blot analysis indicated that the the sigB gene is also present in S. epidermidis and Northern analyses of the sigB and the ica transcription revealed that both genes are activated under identical conditions (i. e. in the stationary growth phase and by external stress factors) suggesting a similar regulatory pathway as in S. aureus. However, since neither in S. aureus nor in S. epidermidis the ica promoter has obvious similiarities to known SigB-dependent promotoer sequences it is tempting to speculate that the ica activation is not directely mediated by SigB, but might be indirectely controlled by other SigB-dependent regulatory elements which remain to be elucidated. / Die Ausbildung von Biofilmen ist ein wichtiger Schritt in der Pathogenense von Polymer-assoziierten Infektionen durch S. epidermidis. Sie hängt von der Expression des icaADBC-Operons ab, das die Syntheseenzyme für die Produktion eines extrazellulären Polysaccharids (PIA) kodiert. PIA steht für Polysaccharid-Interzelluläres-Adhäsin. Diese Substanz stellt ein beta-1,6 verknüpftes N-Acetyl-Glukosaminoglycan dar, das den Bakterien extrazellulär aufliegt, die Adhärenz der Zellen untereinander vermittelt und so die Akkumulation eines Biofilms wesentlich fördert. Epidemiologische und experimentelle Studien haben gezeigt, daß die PIA-Produktion und damit die Biofilmbildung wesentlich zur Virulenz bestimmter S. epidermidis Stämme beiträgt. Die vorliegende Arbeit zielte auf die Untersuchung äußerer Faktoren ab, die die PIA-Expression in S. epidermidis regulieren. Dazu wurde eine Genfusion zwischen dem ica-Promotor und dem beta-Galaktosidasegen aus E. coli hergestellt und stabil in das Chromosom eines ica-positiven S. epidermidis Klinikisolates integriert. Das Reportergenkonstrukt wurde benutzt, um den Einfluß verschiedener Umweltfaktoren und die Wirkung subinhibitorischer Antibiotikadosen auf die Expression des ica-Operons zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, daß die ica-Expression wachstumsphasenabhängig ist und ihr Maximum in der späten logarhitmischen und frühen stationären Phase erreicht. Die optimale Expressionstemperatur liegt bei 42 °C und einem neutralen pH-Wert in einem Bereich zwischen 7,0 und 7,5. Die Biofilmbildung hängt stark vom Glukosegehalt des Wachstumsmediums ab. So wurde gezeigt, daß 1,5 bis 2 Prozent im Kulturmedium die ica-Expression in der logarhitmischen Phase induzieren. Externe Stressfaktoren wie erhöhte Osmolarität durch 3 bis 5 Prozent NaCl oder sublethale Dosen von Detergenzien, Äthanol, Wasserstoffperoxid und Harnstoff begünstigen ebenfalls die ica-Expression und damit die Biofilmbildung. Subinhibitorische Dosen von Tetrazyklin, des Streptogramingemisches Quinupristin/Dalfopristin (Synercid?) sowie des Streptogramin-Leistungsförderers Virginiamycin führten zu einer Erhöhung der ica-Expression um das 8 bis 11-fache. Eine kurzzeitige Exposition der Bakterien zu hohen Konzentrationen dieser Antibiotika führte ebenfalls zu einer langanhaltenden Induktion der Biofilmexpression, auch wenn die Stoffe aus dem Wachstumsmedium sofort wieder entfernt worden waren. Andere Antibiotika wie Penicillin, Oxacillin, Gentamicin, Clindamycin, Vancomycin, Teicoplanin und Chloramphenicol zeigten keinerlei Effekt auf die ica-Expression. Eine schwache Induktion wurde dagegen für Erythromycin verzeichnet. Die Daten wurden durch Northernblotanalysen der ica–Transkription und durch einen quantitativen Biofilmassay in Polystyrol-Mikrotiterplatten bestätigt. Die Propagierung des Reportergenkonstruktes als Plasmid sowohl in einem B. subtili- Hintergrund als auch in einem ica-negativen S. epidermidis-Stamm ergab, daß die Induktion des ica-Operons durch niedrige Tetrazyklin- oder Streptograminkonzentrationen möglicherweise von spezifischen Regulatoren abhängt, die nur in Staphylokokken vorkommen. Im Gegensatz dazu ist die Induktion durch externe Sressfaktoren sowohl in B. subtilis als auch in S. epidermidis möglich. Durch die Herstellung und Untersuchung einer agr-Mutante in einem Biofilm-bildenden S. epidermidis-Stamm konnte ausgeschlossen werden, daß das Agr-Quorum-Sensing-System einen wesentlichen Einfluß auf die ica-Expression in der stationären Phase ausübt. Dagegen wurde klar gezeigt, daß die ica-Transkription in S. aureus von der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB abhängt, der einen globalen Regulator für die Stressantwort in Staphylokokken und in B. subtilis darstellt. Zu diesem Zweck war eine sigB-Deletionsmutante in einem Biofilm-bildenden S. aureus-Stamm hergestellt worden. Diese Mutante zeigte eine deutlich verminderte ica Transkription und Biofilmbildung. Dagegen wies die Komplementante, die das sigB-Gen auf einem Expressionsvektor trug, wieder alle Merkmale des Biofilm-bildenden S. aureus Wildtyps auf. Southernblot-Analysen zeigten, daß das sigB-Gen auch in S. epidermidis nachweisbar ist und unter denselben Bedingungen (d. h. in der stationären Phase und durch externen Stress) wie das ica Gen transkribiert wird. Das läßt vermuten, daß die Regulation des ica-Operons in S. epidermidis ähnlich abläuft wie in S. aureus und durch SigB beeinflußt wird. Da jedoch weder in S. aureus noch in S. epidermidis der ica-Promotor Ähnlichkeiten zu den bekannten SigB-abhängigen Promotor-Strukturen aufweist, ist anzunehemen, daß dieses Operon nicht direkt durch diesen alternativen Transkriptionsfaktor kontrolliert wird. Wahrscheinlich existieren noch weitere regulatorische Elemente, die hieran beteiligt sind und die noch zu identifizieren sind.

Bislang inhibieren antibakterielle Substanzen in erster Linie die Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel sowie die Proteinsynthese. In dieser Arbeit wurde ein erster Versuch unternommen, neue Zielstrukturen für die Antibiotika-Therapie in S. aureus zu finden. Insgesamt wurden 10 Gene untersucht, die Funktion von 7 dieser Gene war in S. aureus unbekannt. Zunächst sollte herausgefunden werden, ob diese 10 Zielgene: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245, SA0367, für S. aureus essentiell sind. Es wurde versucht, jedes dieser Gene in S. aureus zu deletieren. Außer den Genen SA1444, SA0245 und nusG konnten alle Zielgene deletiert werden und waren daher für S. aureus nicht essentiell. Die Deletionsmutanten ΔtopB, ΔpolA, ΔSA1857, ΔSA1063, ΔSA0453, ΔSA0241, ΔSA0367 wurden außerdem in einem Sepsismodell in Mäusen untersucht und waren nicht attenuiert. Gene, die weder in vitro noch in vivo essentiell sind, sind nur von geringem Interesse für die Entwicklung neuer Antibiotika. Zur Untersuchung essentieller Gene in S. aureus wurden vier verschiedene konditionale Expressionssystem untersucht. Bei drei dieser Systeme wurde der wildtypische Promotor gegen einen regulierbaren Promotor ausgetauscht. Bei einem weiteren System handelte es sich um einen Antisense-RNA-Ansatz. Zur Überprüfung der konditionalen Expressionssysteme („proof-of-principle“) wurden die bekannten essentiellen Gene ligA und dnaE in S. aureus mutiert. Eines dieser konditionalen Expressionssysteme, das pLL30/Pspac/pMJ8426-System, konnte erfolgreich in S. aureus angewandt werden. Die konditionale Expression von ligA und von SA0245 wurde mit diesem System erzielt. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 dieses konditionalen Expressionssystems enthält eine Insertionskassette, die das Antibiotikaresistenzgen cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase) sowie den regulierbaren Promotor Pspac enthält. Ein wesentliches Merkmal des pLL30/Pspac/pMJ8426-Systems ist die stabile Integration des Resistenzmarkers cat und des Pspac-Promotors durch ein doppeltes Crossover Ereignis vor dem Zielgen. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 kann anschließend durch mehrfaches Subkultivieren der Bakterien bei nicht permissiver Temperatur eliminiert werden. Der Repressor LacI wird auf einem Extra-Plasmid pMJ8426 kodiert und wird nach erfolgter Integration des Pspac-Promotors vor dem Zielgen in die Bakterien transformiert. Mehrere Kopien des Repressorplasmids ermöglichen eine gute Repression an Pspac. Durch die Zugabe des Induktors IPTG kann der Repressor LacI inaktiviert und die Gen-Expression induziert werden. Insbesondere konnte dieses konditionale Expressionssystem erfolgreich im Tiermodell angewandt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die genetische und funktionelle Charakterisierung von SA0367. Durch biochemische Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieses Gen für eine FMN-enthaltende Oxidoreduktase codiert. Auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Funktion des Proteins wurde das Gen SA0367, in Analogie zum orthologen Gen nfrA aus B. subtilis, in nfrA umbenannt. Die Oxidoreduktase NfrA oxidiert NADPH in Gegenwart von FMN. In Gegenwart von NADPH und FMN zeigt das Enzym NfrA außerdem Nitroreduktase- und eine leichte Disulfidreduktase-Aktivität. Induktionsexperimente im Wildtyp zeigten, dass nfrA durch oxidativen Stress, verursacht von Diamide oder Nitrofurantoin, und durch Ethanol induziert wird. Ethanol und oxidativer Stress führt zu Denaturierung von Proteinen. NfrA könnte an der Reparatur geschädigter Proteine beteiligt sein. Die Induktion von nfrA in S. aureus erfolgt unabhängig vom alternativen Sigmafaktor SigB. Durch Primer Extension-Experimente wurde eine putative PerR-Box vor dem nfrA-Gen identifiziert. Diese könnte für die Regulation von nfrA wichtig sein. Außerdem wird nfrA während des gesamten Wachstumszyklus von einem SigAabhängigen Promotor exprimiert. Die Deletionsmutante ΔnfrA zeigt nur in Gegenwart hoher Ethanolkonzentrationen von 6,5 % einen leichten Wachstumsnachteil im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem weist die ΔnfrA-Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Nitrofurantoin auf. In weiteren Untersuchungen wurde begonnen die Funktion der Ser/Thr-Kinase SA1063 durch Microarray-Experimente aufzuklären. Hierbei wurde deutlich, dass dieses Gen eine regulatorische Rolle bei der Zellwandsynthese in S. aureus spielen könnte. / So far, antimicrobial substances inhibit primarily the synthesis of the cell wall, DNA- and RNA as well as the synthesis of proteins. In this work, alternative targets for antibiotictherapy in S. aureus were investigated. Consequently, altogether ten different genes were analysed, seven of these genes were of unknown function in S. aureus. The ten target genes chosen were: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245 and SA0367. First, it should be discovered whether or not these target genes are essential for bacterial survival. Therefore, deletion strains of each of these genes were constructed in S. aureus. All of these genes, except of SA1444, SA0245 and nusG, could be deleted, and were thus non-essential in S. aureus. The deletion strains ΔtopB, ΔpolA, ΔSA1857, ΔSA1063, ΔSA0453, SA0241, ΔSA0367 were analysed in a sepsis model of infection in mice. These experiments turned out that none of those strains were attenuated in this model which suggests that the factors investigated are neither in vitro nor in vivo essential for bacterial survival and virulence. Therefore, the potential of these determinants to serve as a target for the development of new antibiotics is rather low. To examine essential genes in S. aureus, four different conditional expression systems were analysed. In three of these systems the promoter of the wildtype gene was exchanged by an experimentally controllable promoter. Another approach involved antisense-RNA to counteract the transcription of the target genes. To verify that the conditional expression systems are functional in S. aureus (“proof-of-principle”), we first mutated two known essential genes, namely ligA and dnaE. One of these conditional expression systems, the pLL30/Pspac/pMJ8426-System could be applied successfully in S. aureus. Conditional mutants of ligA and SA0245 were obtained with this system. The temperature-sensitive shuttle-vector pLL30 of this expression system contains a DNA cassette for insertion in front of the target gene. This insertion-cassette encodes the resistance marker cat (chloramphenicol-acetyltransferase) as well as the Pspac promoter. One important feature of the pLL30/Pspac/pMJ8426-system is the stable integration of the resistance gene cat and the Pspac promoter in front of the target gene by a double crossover event. Following the integration of the cat-Pspac-cassette the temperature-sensitive vector can be eliminated by successive sub-culturing of the bacteria at non-permissive temperature. The repressor LacI is encoded on the Plasmid pMJ8426 which is transformed into the bacteria after integration of the cat-Pspac-cassette in front of the target gene. Several copies of the repressor-plasmid pMJ8426 give rise to high amounts of the repressor LacI and should allow tight repression of the target gene. By addition of the inductor IPTG the repressor LacI is inactivated and gene expression is induced. This conditional expression system was also successfully applied in an animal model of infection. Thus, a validated in vivo expression system is now applicable for the investigation of putative target genes in vivo. Furthermore, in the present work SA0367 was genetically and functionally characterized. Biochemical assays of the gene product revealed that it encodes a FMN-containing oxidoreductase. Based on the findings of this work about the function of the protein, the gene SA0367 was named nfrA, in analogy to the orthologous gene nfrA from B. subtilis. The oxidoreductase NfrA oxidizes NADPH in the presence of FMN. In addition, the enzyme NfrA showed nitroreductase-activity and a minor disulfidreductase-activity in the presence of FMN and NADPH. Induction experiments in the wildtype showed that nfrA is induced by oxidative stress caused by diamide or nitrofurantoin and by ethanol. Ethanol and oxidative stress cause denaturation of proteins. Therefore, NfrA could be involved in the repair of damaged proteins. The induction of nfrA is independent of the alternative sigma-factor SigB. Primer-extension experiments revealed a putative PerR-Box in front of the nfrA-gene. This PerR-Box could be important for the regulation of the expression of nfrA. Moreover, nfrA is transcribed throughout the whole life cycle of S. aureus from a SigA-dependent promoter. Growth of the deletion strain ΔnfrA was slightly reduced in the presence of 6,5 % ethanol as compared to the wildtype. The ΔnfrA-mutant also shows a higher resistance towards nitrofurantoin. In addition, the function of the Ser/Thr-kinase SA1063 was investigated by DNAmicroarray- experiments. Several genes were differentially regulated when comparing transcription of the wildtype and its isogenic ΔSA1063-mutant. The results of these experiments implicate a regulatory role of that SA1063 in the cell wall synthesis in S. aureus.

Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern. / The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins.

Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt. / Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen that can cause a wide range of diseases in humans and animals. The outcome of an infection can range from mild skin infections to life-threatening infections, like endocarditis, bacteraemia and pneumonia. Currently, methicillin-resistant S. aureus strains (MRSA) that have acquired numerous additional resistances towards several antibiotics have established in the hospital-setting. Therefore, the treatment of hospital-acquired infections with S. aureus in a rising number of patients is becoming increasingly complicated. The remaining effective antibiotics to treat infections with multi-resistant MRSA are vancomycin, synercid, and linezolid. However, MRSA isolates with intermediate and high resistance towards vancomycin have been described recently, as well as synercid- and linezolid-resistant strains. The emergence and spreading of multi-resistant S. aureus is alarming and emphasises the need to develop new antibiotics. Currently, well-established therapeutics targeting processes of cell wall biosynthesis, DNA and RNA metabolism, and protein biosynthesis. This study comprises the investigation of putative targets of novel antibiotics. Therefore, seven target genes were selected and functionally characterised in vitro and in vivo. Four of these genes have not been characterised in S. aureus at the beginnig of this study. A deletion mutagenesis approach for these genes (clpP, purH, ssrA and smpB) should provide an indication of their essientiallity for the organism. clpP and purH could be successfully inactivated, supporting their non-essential role in S. aureus. The non-essential genes arlR, arlS and putP were inactivated and different phenotypic studies of the S. aureus deletion mutants ∆clpP, ∆arlR, ∆arlS, ∆purH and ∆putP were performed. Whole genome microarray analysis was applied on ∆clpP and ∆arlR mutants to study the manifold transcriptional changes by the inactivation of these two regulators in S. aureus. The growth rate of ∆clpP was strongly reduced at different temperatures (30°C, 37°C, 42°C) and completely inhibited at 20°C. Growth was highly impaired under anaerobic conditions. Moreover, ClpP deficiency resulted in a reduced hemolytic activity and diminished adherence to polystyren as well as a strongly enhanced autolytic activity. The invasiveness of ∆clpP was significantly elevated (~10-fold) compared to the isogenic wildtype as shown in an invasion assay with the 293T epithelial cell line. All these effects could be successfully reverted by complementation of the mutant strain with a vector expressing the native clpP sequence. The microarray analysis of ∆clpP revaeled a strong shift of the bacterial transcriptome (15 % of all genes were differentially regulated). Especially regulators and genes which reply to varying redox conditions, for example as a result of different stresses or anaerobiosis, were shown to be affected at the transcriptional level. Deletion mutants of the virulence-associated two component system genes arlR and arlS caused a higher hemolytical activity, enhanced adherence to polystyrene and an enhanced autolytic activity in a Triton X-100 assay. Furthermore, internalisation of arlRS bacteria by 293T epithelial cells was diminished, and ∆arlR was significantly less infectious than the wildtype in a catheter-related infection model in rats. The microarray analysis of ∆arlR in the exponential and stationary growth phase revealed a strong influence of the ArlRS-system on gene expression in S. aureus. In the exponential phase a total of 5 %, and in the stationary phase 15 % of all genes were differentially regulated. ∆purH and ∆putP showed no alterations of growth, biofilm formation or hemolytic properties compared to the wild type strain. Inactivation of purH, however, caused a significant attenuation of S. aureus MA12 in a rat-infection model. Since the construction of ssrA and smpB deletion mutants have failed, conditional lethal expression systems should be utilised to address the question of essentiality of these genes. It could be shown by this study that neither the genetic exchange of the wildtype promoter with an in vitro adjustable promoter nor an antisense RNA-based approach were sufficient to clearify the status of ssrA and smpB as essential genes in S. aureus. Importantly, the expression of antisense RNAs for both genes resulted in a growth defect of S. aureus

Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue ökologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der Fähigkeit, Biofilme auf abiotischen Oberflächen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilität. Ein markantes Beispiel für genotypische Variabilität ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und präzise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON“ Mechanismus der Phasenvariation, die präzise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabhängigen Prozess vollständig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Präzise Exzision war hingegen abhängig von der Integrität der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte präzise Exzision Transposase-unabhängig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision für die vollständige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verkürzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war präzise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verkürzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der präzisen Exzision ca. dreifach erhöht. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionshäufigkeit im Ungleichgewicht stehen. Während der Durchführung der Experimente zur präzisen Exzision aus icaC wurden nach mehrtägiger Passage häufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Phänotyp als der Wildtyp auf. Anstelle von fädiger extrazellulärer Substanz wie beim Wildtyp wurde verstärkt eine polymorphe, aus globulären Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 % NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollständig, während es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 % Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich stärkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erhöhten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis über einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verfügt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung führen kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro näher charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog überexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erhöhte Affinität zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verkürzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Domäne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminosäuren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA überprüft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen führten zu einer stark abgeschwächten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsvermögens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdomäne eines Elements der IS256-Familie näher beschrieben. / During the past decades, Staphylococci, especially Staphylococcus aureus and the coagulase-negative Staphylococcus epidermidis, have been established as a predominant cause of nosocomial infections. This remarkable adaptation to a new ecological niche by S. epidermidis is due to three main factors: (i) the ability to colonize abiotic surfaces as biofilms, (ii) the acquisition of multiple resistances to antibiotics and (iii) a high genotypic and phenotypic variability. A prominent example of genotypic and phenotypic variability is phase variation in biofilm formation caused by insertion and excision of the insertion sequence IS256 within the ica operon. In the first part of this thesis, the mechanism of “OFF-ON” transition, caused by precise excision of IS256 from the ica operon, was studied. It was demonstrated that IS256 including the duplicated 8 bp target site is excised completely from the chromosome in a transposase-independent manner, neither accompanied by chromosomal rearrangements nor new insertions. However, precise excision depended on the integrity of the target site duplications. Even after insertion of IS256 onto a plasmid (spc::IS256) transposase-independent precise excision was detected. The probability of this event was calculated to be 1x10-11 per cell generation. After shortage of the microhomology between the 8 bp target site duplications to 6 bp or less, precise excision was not detectable any longer. Deletion of the transposase gene, leading to a 160 bp IS256 fragment still harbouring complete inverted repeats and flanked by intact target site duplications, enhanced the probability of precise excision about threefold. These observations support the hypothesis that precise excision is caused by the illegitimate recombination process of replicational slippage. Furthermore, the data indicate an imbalance between insertion and excision of IS256 within the phase variation process. When studying precise excision from icaC, strong biofilm producing variants still carrying the icaC::IS256 insertion were isolated frequently after several days of passaging. Such biofilm-positive, PIA-negative variants showed a phenotype different from the wild type as displayed by Atomic force microscopy. Instead of a fibrous extracellular substance as in the wild type, the variants produced a polymorphous matrix formed by more or less globular substructures. In contrast to the wild type growing in a polysaccharide-mediated biofilm, the alternative biofilm´s extracellular matrix consisted of proteins. Regulation of proteinaceous biofilm formation differed compared to PIA-dependent biofilm. Addition of 4 % sodium chloride abolished proteinaceous biofilm formation completely, while it induced biofilm formation in the wild type. Addition of 3 % ethanol caused a considerably stronger induction of biofilm formation compared to the wild type. The transcript level of accumulation associated protein, aap, was enhanced in comparison to the wild type; an observation that was also confirmed at the protein level. Taken together, these data indicate that S. epidermidis is capable of switching to an alternative mode of biofilm formation, thus possibly modulating the previously described phase variation by IS256 insertion and excision. In the third part of this thesis, specific binding of IS256 transposase was characterized in vitro. To this end, IS256 transposase was overexpressed heterologously and purified using an N-terminal calmodulin binding tag (CBP). In electrophoretic mobility shift assays (EMSA) CBP-transposase bound to IRL and IRR containing DNA fragments specifically, albeit with slightly higher affinity to IRR. Binding of CBP-transposase to the inverted repeats within circle junction DNA as well as unspecific end binding could be confirmed by Atomic force microscopy. Deletions within the sequence of the right or left inverted repeat revealed that CBP-transposase binds to the inner part of the inverted repeats. EMSA experiments with truncated transposase derivatives suggested a DNA binding motif within the N-terminal domain of the transposase. The identified protein region (amino acid 100 – 130) consists of two a-helices separated by a short turn, displaying typical features of a helix-turn-helix motif. Six conserved amino acid residues within this putative motif were exchanged by point mutations and the effect of the mutation was tested in EMSA. Exchange of L103 and L127 against the helix-breaking amino acid proline had no detectable effect on DNA binding. However, exchange Y111A, G114W, T117A and R118A strongly reduced or completely abolished DNA binding. This is the first description of a DNA binding domain of a member of the IS256 family.