Ce travail de recherche a eu pour objectif de caractériser l’influence du génotype de porte-greffes sur le développement du greffon notamment à travers l’étude des mécanismes relatifs à la signalisation azotée et hormonale. Dans ce contexte, deux porte-greffes, 1103 Paulsen (1103P) et Riparia Gloire de Montpellier (RGM), induisant respectivement une forte et faible vigueur du greffon, ont été étudiés. Une analyse du transcriptome racinaire a été effectuée chez des plants greffés impliquant ces deux génotypes dans un système split-root où la disponibilité en azote était hétérogène. Une réponse plus prononcée a été observée pour le génotype RGM, ainsi qu’une régulation temporelle différente entre les deux génotypes, notamment concernant des gènes clés de la réponse au nitrate intervenant dans la régulation de la croissance des racines ou dans la signalisation hormonale. D’un point de vue développemental, une régulation étroite de la production des racines latérales et des rameaux latéraux par la disponibilité en azote a été mise en évidence chez RGM. D’autre part, les propriétés intrinsèques de chaque porte-greffe semblent être conférées au greffon induisant notamment une ramification plus importante de celui-ci lorsque le porte-greffe 1103P est utilisé. La caractérisation fonctionnelle des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des strigolactones et la réalisation de bio-essais ont permis de mettre en évidence la production de composés de type strigolactones chez la Vigne. Ces travaux suggèrent aussi une balance contrastée entre les strigolactones et les cytokinines au sein des deux génotypes, corrélée à leur capacité de contrôle de la croissance du greffon. L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence une réponse transcriptomique et développementale à la disponibilité en azote toujours plus prononcée pour le génotype connu pour conférer le moins de vigueur au greffon, RGM. / This work aimed to characterize the impact of the rootstock genotype on the scion development especially through the study of the mechanisms related to nitrogen and hormonal signalling. In that context, two rootstocks were studied, 1103 Paulsen (1103P) and Riparia Gloire de Montpellier (RGM), inducing high and low scion vigour, respectively. A transcriptomic analysis was performed on roots of grafted plants involving both genotypes, cultivated in a split-root system where the nitrogen availability was heterogeneous. A more pronounced response was observed for RGM together with a different temporal regulation between both rootstocks, in particular concerning the expression of key genes of the nitrate response involved in root growth regulation or in hormonal signaling. Concerning plant development, a clear impact of the nitrogen availability on the production of lateral roots and shoot branching was highlighted for RGM. Moreover, the intrinsic properties of each rootstock seemed to be conferred to the scion inducing especially a higher shoot branching when the rootstock 1103P was used. The functional characterization of the genes involved in the strigolactone biosynthesis pathway and bioassays highlighted the production of strigolactone-like compounds in Grapevine. These experiments suggest also a contrasted balance between strigolactones and cytokinins within each rootstock genotype, correlated with their ability to control the scion growth. Taking together, these results showed a pronounced transcriptomic and developmental response to nitrogen availability for the genotype conferring the lowest scion vigour, RGM

Carotenoids are precursors of hormones and signaling molecules across all kingdoms of life. An increasing body of evidence suggests the presence of yet unidentified carotenoid-derived metabolites (apocarotenoids) with developmental and regulatory functions, besides the known plant hormones abscisic acid (ABA) and strigolactones (SLs). Generally, apocarotenoid synthesis is initiated by carotenoid cleavage dioxygenases (CCDs), which constitute a ubiquitous family of non-heme iron enzymes. In SL biosynthesis, an iron-binding cis/trans-isomerase, DWARF 27 (D27) converts all-trans-β-carotene into 9-cis-β-carotene. This reaction is followed by a double bond cleavage at 9, 10 position, mediated by the stereospecific CCD7. The cis-configured cleavage product of CCD7, 9-cis-β-apo-10’-carotenal, is simultaneously cleaved, triple-oxygenated and rearranged by CCD8, to produce carlactone (CL). CL is a central metabolite and the precursor of a wide range of SLs. The aim of this work is to investigate whether CCD8 synthesize CL-like compounds from other 9-cis-configured apocarotenoids to confirm their presence and synthesis in planta. We showed that CCD8 enzymes from different plants produce a hydroxylated carlactone (3-H-CL) from 9-cis-3-OH-β-apo-10’-carotenal in vitro. In addition, we detected 3-H-CL in Nicotiana benthamiana leaves transiently expressing the CL biosynthesis enzymes from rice and Arabidopsis. 3-H-CL is biologically active, as shown by Striga hermonthica seed germination assay and by its effect on the high-tillering phenotype of the rice d10 mutant. We also confirmed that 3-H-CL is a natural metabolite by detecting it in roots of the rice SL perception mutant d14. In a second project, we investigated the activity of three rice CCDs in vitro and showed that one of them (zaxinone synthase; ZAS) is an apocarotenoid cleavage enzyme with a clear preference for the substrate all-trans-3-OH-β-apo-10’-carotenal, as suggested by a kinetic study. ZAS produces two products, the C18 ketone zaxinone and an unstable C9 dialdehyde that could be identified by LC-MS after derivatization. Activity tests were performed with crude lysates of overexpressing Escherichia coli cells and with purified enzyme. We established that zaxinone is a natural metabolite present in planta. Investigations of a corresponding rice mutant (zas) and activity bioassays performed by our group demonstrate that zaxinone a novel signaling molecule required for normal rice growth and development.

La croissance et le développement des plantes sont sous l’influence de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Parmi eux les hormones végétales participent aux multiples processus qui conduisent à la formation d’une plante via la mise en place d’un réseau complexe d’interactions et de rétro-contrôles. Le contrôle de la ramification implique trois d’entre-elles : l’auxine et les strigolactones (SLs) qui inhibent le démarrage des bourgeons et les cytokinines (CKs) qui le stimulent. Différents mécanismes d’interactions entre ces signaux dans le contrôle de la ramification sont connus. L’auxine contrôle les niveaux de SLs et de CKs, et les voies SLs et CKs convergent vers la même cible, le facteur de transcription BRC1.Chez le pois, les mutants hyper-ramifiés ramosus (rms) sont affectés dans la voie SLs. Les gènes RMS1 (PsMAX4) et RMS5 (PsMAX3) contrôlent la biosynthèse des SLs alors que RMS3 (PsD14) (récepteur) et RMS4 (PsMAX2) sont impliqués dans la perception des SLs. En plus de partager un phénotype hyper-ramifié, les mutants rms présentent un phénotype de nanisme. Cependant le rôle des SLs dans le contrôle de la taille des plantes n’était pas encore connu. Nous avons montré que les SLs contrôlent la taille des plantes en jouant sur le processus de division cellulaire indépendamment de la voie gibbérelline.Les mutants rms montrent des caractéristiques physiologiques similaires : un haut niveau d’expression des gènes de biosynthèse des SL et une faible teneur en CKs dans la sève xylémienne (X-CKs). En revanche, le mutant hyper-ramifié rms2 présente une faible expression des gènes de biosynthèse des SLs et une forte teneur en X-CKs. De précédentes études suggèrent que rms2 est affecté dans un signal tige-racine de rétro-contrôle régulant la biosynthèse des SLs et le niveau de X-CKs. La nature biochimique de ce signal est inconnue et il a été proposé que ce signal soit auxine-indépendant.Nous avons montré que le gène RMS2 est l’homologue chez le pois des gènes AFB4/5 d’Arabidopsis codant pour une protéine à boîte-F de la famille des récepteurs de l’auxine TIR1/AFBs (Auxin signaling F-Box). Ce qui suggère que le signal de rétro-contrôle RMS2-dépendant est l’auxine. De plus nos résultats montrent que les SLs jouent un rôle de répresseur du niveau d’auxine dans la tige via la régulation de l’expression des gènes du métabolisme de l’auxine.L’ensemble de ces résultats montrent que dans le processus de contrôle de la ramification les interactions entre auxine et SLs sont complexes. Les multiples mécanismes en jeux aboutissent à la formation d’une boucle de régulation dans laquelle chaque hormone est capable de contrôler la biosynthèse de l’autre. / The different processes of plant growth and development are under the influence of growth regulators which interact in complex hormonal networks and feedback mechanisms. The control of shoot branching involves 3 key plant hormones, auxin, cytokinins (CKs) and strigolactones (SLs). Auxin and SLs repress axillary bud outgrowth whereas CKs stimulate it. Different mechanisms of interactions between these signals have already been suggested in controlling shoot branching. Auxin controls SLs and CKs levels, and SLs and CKs pathways converge on the same target, the TCP transcription factor BRC1 in the axillary bud. In pea, the high shoot branching of ramosus (rms) mutants are known for being impaired in the SLs pathway. RMS1 (PsMAX4) and RMS5 (PsMAX3) genes are involved in SL biosynthesis while RMS3 (PsD14) (receptor) and RMS4 (PsMAX2) are involved in SL perception. In addition to sharing their high branching phenotype, the rms mutants display a dwarf phenotype. However the role of SLs in controlling plant height was unknown. Here we show that SLs control internode length by acting on cell division in a Gibberellin-independent way.The rms mutants show similar physiological characteristics: high expression of the SL-biosynthesis genes and very low xylem-sap CKs (X-CKs) content. In contrast, the rms2 mutant with similar shoot phenotype shows very low expression of SL-biosynthesis genes and high X-CKs content. Previous studies suggested that rms2 was affected in a shoot-to-root feedback signal controlling both SL biosynthesis and X-CKs level. Whether this feedback signal was auxin or not was highly discussed. Here we demonstrated that the RMS2 gene is the pea homologue of the Arabidopsis AFB4/5 gene, encoding an F-box protein which belongs to the TIR1/AFB (Auxin signaling F-Box) auxin receptor family. This suggests that the RMS2-dependent feedback signal is very likely auxin. Moreover our results suggest a role for SLs in the repression of auxin content in pea stem via the regulation of auxin metabolism gene expression. These results highlighted that for the control of shoot branching, interactions between auxin and strigolactones involve multiple mechanisms leading to regulation loop where both hormones are able to regulate the biosynthesis of each other.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2013. / ENGLISH ABSTRACT: Sutherlandia frutescens (L.) R. Br., also known as Lessertia frutescens, is a leguminous shrub indigenous to southern Africa. Traditionally this plant has been used for the treatment of various ailments; current interest in this plant has escalated after it was announced that extracts could aid in the relief and treatment of HIV/AIDS. These extracts contain an array of metabolites, including sutherlandins, sutherlandiosides L-arginine, L-canavanine, asparagine, gamma-aminobutyric acid (GABA), and various other amino acids, which have been linked to medicinal uses. This study focused on the use of hormones to promote the growth and metabolite production of S. frutescens in vitro cultures. The growth promoting substances used in this study were synthetic analogues of strigolactones, GR24 and Nijmegen-1, and auxins, indole-3-butyric acid (IBA) and naphthalene acetic acid (NAA). The first part of this study focused on the effects strigolactones and auxins, alone and combined, had on the growth of S. frutescens in vitro nodal explants. The S. frutescens nodal explants had the most significant improvement in growth with treatments that contained 1 mg/L NAA. These treatments increased growth via fresh and dry mass and plant length. The metabolite content of these nodal explant cultures was evaluated using liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) metabolite analysis. The treatments that contained 1 mg/L NAA differed in metabolite composition and showed an increase in metabolite quantity. The SU1 content of the treated plants was also quantified using LC/MS techniques and a combination of 1 mg/L NAA and Nijmegen-1 doubled the amount of SU1. The effect of strigolactones was also studied using hairy root cultures of S. frutescens. Strigolactones alone slightly inhibited the formation of lateral transgenic roots, but when these chemicals were used in combination with auxins, significant reduction in dry mass and lateral root outgrowth resulted. Of the treatments tested in this study, 0.1 mg/L IBA caused noticeable alterations to the metabolite pool, with amino acids such as GABA and arginine accumulating at higher levels than the control explants. The exploitation of hormones to up-regulate the growth and metabolism of the medicinally important plant, Sutherlandia frutescens, proved successful in this study. The use of in vitro nodal explants along with hairy root cultures has assisted in the establishment of a stable system for the up-regulation of metabolites. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sutherlandia frutescens (L.) R. Br., ook bekend as Lessertia frutescens, is 'n peulagtige struik inheems tot suider Afrika. Tradisioneel is die plant vir 'n groot verskeidenheid van kwale gebruik; huidige belangstelling in die plant het toegeneem nadat dit bekend gemaak was dat ekstraksies vanaf hierdie plant verligting kan bied vir MIV/VIGS. Hierdie ekstrakte bevat 'n verskeidenheid van metaboliete, insluitend sutherlandins, sutherlandiosiede L-arginien, L-kanavanien, asparagien, gamma-aminobottersuur (GABS), asook verskeie ander aminosure wat medisinale gebruike het. Die studie het gefokus op die gebruik van hormone om die groei en metaboliete van S. frutescens in vitro kulture te vermeerder. Die groei reguleerders wat in hierdie studie gebruik was, was die sintetiese analoë van strigolaktoon, GR24 en Nijmegen-1, asook die ouksiene, indool-3-bottersuur (IBS) en naftaleen asynsuur (NAS). Die eerste deel van die studie het gefokus op die effek van strigolaktoon en ouksien, alleen en in kombinasie, op die groei van S. frutescens in vitro nodale mikrostingels. Die S. frutescens nodale mikrostingels wat behandel was met 1 mg/L NAS het die aansienlikste toename in groei getoon. Hierdie behandeling het groei bevorder deur middel van vars en droë massa en plant lengte. Die metaboliet inhoud van die behandelde mikrostingels was met behulp van vloeistofchromatografie/massa spektrometrie (VC/MS) ondersoek. Al die behandelinge wat 1 mg/L NAS bevat het, het in metaboliet samestelling verskil en het ook 'n toename in metaboliet hoeveelheid getoon. Die SU1 inhoud van die behandelde plante was ook met behulp van VC/MS tegnieke gekwantifiseer en dit was gevind dat 'n kombinasie van 1 mg/L NAS en Nijmegen-1 die hoeveelheid SU1 verdubbel het. Die effek van strigolaktoon op harige wortel kulture van S. frutescens was ook ondersoek. Strigolaktoon alleen het die formasie van laterale transgeniese wortels effens inhibeer, maar wanneer hierdie chemikalieë saam met ouksiene gebruik was, was die aansienlike afname van die massa en inhibisie van die laterale wortel uitgroeisels meer prominent. Van al die behandelinge wat in hierdie studie getoets is, het 0.1 mg/L IBS die mees merkbare veranderinge in metaboliete meegebring en aminosure soos GABS en arginien het teen hoër vlakke versamel. Die uitbuiting van hormone om groei en metaboliet produksie te bevorder in die belangrike medisinale plant, Sutherlandia frutescens, was suksesvol in hierdie studie. Die gebruik van nodale mikrostingels asook harige wortel kulture het bygedra om 'n stabiele sisteem te vestig vir die vermeerdering van metaboliete.

Plants have evolved different communication mechanisms that convey information encoded in chemical signals, both internally and to surrounding organisms. Two such signals are strigolactones (SLs) and nitric oxide (NO). SLs are plant hormones that shape plant architecture according to nutrition availability and mediate interactions with beneficial arbuscular mycorrhizal fungi. For this second purpose, plant roots release SLs into the soil where they also trigger seed germination in root parasitic weeds, such as Striga hermonthica. Attachment of Striga causes severe damage to crops yield, particularly in sub-Saharan Africa. One way to control this threat to food security in infested African regions is to develop SL antagonists, which can inhibit Striga germination. Recently, we have shown that Triton X-100 can bind to the Striga SL-receptor, HYPOSENSITIVE to LIGHT 7 (ShHTL7). In addition, triazole urea compounds have been shown to specifically bind to Oryza sativa SL-receptor DWARF-14 (OsD14), blocking SL signalling. Here we used the structures of Triton X-100 and triazole urea to design two isomers and putative ShHTL7 inhibitors: KK023-N1 and KK023-N2. We demonstrate that these compounds antagonize SL signalling in S. hermonthica via specific binding to ShHTL7, and that application of KK023-N1 results in a 38% reduction in Striga germination under greenhouse conditions. Furthermore, we discovered a histidine residue (H51) in ShHTL7, which may be involved in SL perception in addition to known residues. Substitution of H51 to asparagine (N) led to a significant reduction in ShHTL7 hydrolysis activity, indicating the importance of this H residue. Our work provides a starting point for designing new series of SLs inhibitors to combat Striga, and improve food security worldwide. NO is a gaseous signaling molecule involved in regulating plant development and adaptive responses to biotic and abiotic stresses. In this work, we characterized AtLRB3, a Light Response Bric-a-Brac/Tramtrack/Broad Complex (BTB) family protein, and showed that it contains a Heme Nitric Oxide/Oxygen (H-NOX) domain that can sense NO, providing an evidence of the existence of NO binding proteins in planta.

Strigolactones (SLs) are a class of plant hormones regulating several aspects of plant growth and development according to nutrient availability, particularly the modulation of root and shoot architectures. Under nutrient deficiency, SLs are abundantly released into the soil to recruit a plant-beneficial partner, arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), and establish plant-AMF symbiosis that provides the plant with minerals and water. However, released SLs are also seed germination signals for the root parasitic plants Orobanchacea family and pave their way to the host plants’ roots. “New comers” in the field of plant hormones, their large structural variety intrigues and led to ask why plants produce many different types of SLs. In this work, we generated tools that can help to link the SL structural diversity with their biological function(s). The most common way to evaluate SL activity is based on their ability to be parasitic seeds’ germination stimulants. Despite being the most sensitive assay for SL quantification, parasitic seed-based bioassays are laborious and time-consuming as performed usually manually. Therefore, we developed a detection algorithm, SeedQuant, which identifies and counts germinated and non-germinated seeds 600 times faster than a trained human; thus, reducing the data processing from days down to minutes. To gain quantitative insights in SL perception, depending on the structural diversity, we developed a precise and detailed protocol for the use of a genetically encoded biosensor in Arabidopsis protoplast, StrigoQuant. StrigoQuant takes advantage of the SL-dependent degradation of the repressor protein AtSMXL6 coupled with luciferase reporter proteins. We also tried to adapt this molecular sensor to the rice repressor protein D53, but the use of rice protoplasts made it very challenging. Moreover, to better understand the later steps in SL biosynthesis in vivo, we generated CRISPR/Cas9-based rice mutants and shed light on the biological function of different SLs at the organismal level. MAX1-900 mutants defined the minor role of the canonical SL 4-deoxyorobanchol (4DO) - a major plant SL - in determining rice architecture, while being a crucial contributor to rhizospheric interactions. Finally, we reviewed other strategies to decipher plant signaling pathways in general.

Carotenoids are the precursor of several metabolites with regulatory functions, which include the plant hormones abscisic acid (ABA) and strigolactones (SLs), and signaling molecules, such as β-cyclocitral. These carotenoid-derivatives originate from oxidative breakdown of the double bond resulting in carbonyl cleavage-products designated as apocarotenoids. The cleavage reaction causing apocarotenoid formation is catalyzed frequently by Carotenoid Cleavage Dioxygenases (CCDs). Several lines of evidence indicate the presence of yet unidentified apocarotenoids with regulatory or signaling function. Here, we first characterized the biological functions of the apocarotenoid zaxinone formed by ZAXINONE SYNTHASE (ZAS), a member of an overlooked, widely distributed plant CCD clade. The loss-of-function rice zas mutant contains less zaxinone, exhibiting retarded growth with elevated levels of SLs that determines plant architecture, mediates mycorrhization, and facilitates the germination of root parasitic seeds, such as Striga spp. The zaxinone treatment rescued zas phenotypes, down-regulated SL biosynthesis and release, and enhanced root growth in the wild-type rice seedlings. Next, we performed multi-omics analysis demonstrating zaxinone increased sugar metabolism and induced photosynthesis in a manner that led to phenotypical changes in rice roots. Besides, transcriptome analysis showed that zaxinone upregulated CYTOKININ GLUCOSYLTRANSFERASES expression in roots, which might explain the increase in the apex and meristem length, and in the number of cellular layers. Finally, the investigation of zaxinone biology and the utilization of its application is constrained by its laborious organic synthesis and low abundance in natural sources. Therefore, we developed easy-to-synthesize and highly efficient Mimic of Zaxinone (MiZax), based on the structure-activity-relationship study using a series of apocarotenoids. Activity-based experiments unraveled MiZax3 and MiZax5 were at least as active as zaxinone in rescuing root phenotypes of the zas mutant, promoting root growth in wild-type seedlings, and reducing SL biosynthesis and release. Taken together, zaxinone is a key regulator of rice growth and development, which regulates sugar metabolism, suppresses SL biosynthesis, fine-tunes cytokinins level, and modulates biotic interactions with arbuscular mycorrhizal (AM) fungi. Our work also provides easy-to-synthesize mimics for illuminating zaxinone biology and as a tool to improve crop growth and reduce the infestation by Striga hermonthica, a severe threat to food security worldwide.

Ce travail de thèse présente la mise au point d’une nouvelle stratégie de synthèse en vue de l’obtention d’analogues des strigolactones, apocaroténoïdes possédant de multiples activités biologiques d’intérêt agronomique : médiateurs chimiques intervenant dans la mise en place de la symbiose endomycorhizienne et nouvelle classe d’hormone végétale contrôlant l’architecture de la plante.La stratégie de synthèse est basée sur l’utilisation d’une séquence de deux réactions clefs qui sont une métathèse cyclisante d’oléfine (RCM) et une cyclisation radicalaire avec transfert d’atome catalysée par un métal de transition (ATRC). Tout d’abord, une synthèse rapide et efficace des précurseurs a été développée et après optimisation de la séquence RCM / ATRC, divers analogues fonctionnalisés en position C4 ont été obtenus après aménagements fonctionnels. D’autres bioisostères des strigolactones naturelles ont été synthétisés par variation au niveau du cycle C. En se basant sur la voie synthétique précédemment élaborée, la première synthèse asymétrique du Solanacol a été effectuée permettant la détermination de sa stéréochimie relative en C2’ et sa configuration absolue. L’évaluation des activités biologiques dans les différents modèles des composés synthétisés est aussi décrite. / This Ph.D. work has been centred on the elaboration of a new synthetic strategy in goal to obtain analogues of natural strigolactones, apocarotenoids with various biological activities of agronomic interests: chemical mediators implicated in the endomycorrhizal symbiosis and a new class of plant hormone controlling the plant architecture.The synthetic strategy is based on the sequence of two key reactions, which are ring closing metathesis (RCM) and atom transfer radical cyclisation (ATRC). First, a rapid and efficient access to the synthetic precursors has been developed and after optimisation of the RCM / ATRC sequence, several analogues functionnalised at the C4 position were obtained after judicious steps. Other bioisoters were obtained with variations on the C ring. On the basis of the elaborated synthetic pathway, the first asymmetric synthesis of Solanacol was successfully achieved conducting to the determination of the relative stereochemistry at C2’ position and its absolute configuration. The biological evaluations of the synthesized molecules in the different models were also described.

La fusariose des épis est l’une de maladies les plus dommageables des céréales tempérées et est principalement causée par le champignon toxinogène Fusarium graminearum (Fg). Ces dix dernières années, de nombreuses études ont rapporté l’induction transcriptionnelle de gènes de la plante codant pour des cytochromes P450 (P450) en réponse l’infection par Fg. Les P450s constituent une famille enzymatique impliquée dans de nombreuses voies métaboliques, certaines avec des intérêts potentiels dans la résistance face aux maladies. Nous avons utilisé la petite graminée modèle Brachypodium distachyon (Bd) pour caractériser fonctionnellement le premier gène codant pour un P450 induit chez la plante au cours de la fusariose des épis par l’utilisation de lignées altérées dans la séquence ou l’expression du gène Bradi1g75310 codant le P450 BdCYP711A29. Nous avons montré qu’en plus d’être un facteur de sensibilité à la maladie, le gène Bradi1g75310 est impliqué dans une voie de biosynthèse hormonale chez Bd, celle des strigolactones (SLs). En effet, en plus de complémenter génétiquement les phénotypes aériens de la lignée mutante max1-1 d’Arabidopsis thaliana altérée dans le gène homologue MAX1 (AtCYP711A1), une lignée de Bd surexprimant Bradi1g75310 (lignée OE) exsude davantage d’orobanchol, une SL spécifique, que la lignée sauvage ou mutante. Une analyse préliminaire de l’impact direct de l’orobanchol sur la croissance de Fg semble indiquer une activation des étapes précoces du développement du champignon (germination) qui pourrait être à l’origine de l’induction plus rapide de gènes de défenses observée chez une lignée OE de Bradi1g75310. Nous avons également montré que les 4 paralogues de Bradi1g75310 chez Bd, qui codent également pour des CYP711A, sont tous capable de complémenter la lignée max1-1 et avons généré du matériel végétal fondamental pour la poursuite de l’étude de la diversification des SLs chez la plante monocotylédone modèle Bd. Au global, ce projet constitue une première étape dans la caractérisation de l’implication des P450 dans la réponse de la plante face à l’infection par Fg en plus de donner de nouveaux indices concernant le rôle des SLs dans les interactions plante-pathogène. Les résultats obtenus au cours de ce travail de thèse pourront permettre l’amélioration de caractères tant développementaux que de résistance à la fusariose chez les céréales cultivées. / Fusarium Head Blight (FHB) is one of the most important diseases of temperate cereals and is mostly caused by the toxin producing-fungus Fusarium graminearum (Fg). This last decade, several studies reported the transcriptional activation of cereal cytochrome P450-encoding genes (P450s) in response to Fg infection. P450s constitute an enzymatic family participating in very diverse metabolic pathways with potential interest for disease resistance. We used the model temperate cereal Brachypodium distachyon (Bd) to functionally characterize the first FHB-induced P450- encoding gene using Bd lines altered in the locus or gene expression of the Bradi1g75310 gene encoding the BdCYP711A29 P450. We showed that in addition to be a plant susceptibility factor towards the disease, the Bradi1g75310 gene is involved in the hormonal biosynthetic pathway of strigolactones (SLs) in Bd. Indeed, in addition to genetically complement the shoot phenotypes of the Arabidopsis thaliana mutant line for the homologous gene MAX1 (AtCYP711A1, max1-1 line), a Bd linewhich overexpresses the Bradi1g75310 gene (OE) exudes more orobanchol, a specific SL, compared to wild-type or mutant lines. Preliminary analysis of the direct impact of orobanchol on Fg growth suggests an activation of early fungal development (germination) likely to induce faster induction of defense-related genes during FHB, observed in Bradi1g75310 OE line. We showed that the four paralogs of Bradi1g75310 encoding BdCYP711A P450s are all able to genetically complement max1-1 line and provide important plant material for studying SLs diversification in the model monocot B. distachyon. Overall, this project constitutes a first step in the characterization of P450s involvement in plant response towards Fg infection in addition to give new evidences about the role of SLs in plant-pathogen interactions. Results obtained during this Ph.D. project will allow the improvement of both developmental and FHB-related traits in cereal crops.

Pflanzen verfügen über ein hohes Maß an phänotypischer Plastizität. Modifikationen ihres genetisch determinierten Aufbaus ermöglichen ihnen, flexibel auf ein breites Spektrum von Umwelteinflüssen zu reagieren. Dies umfasst Veränderungen der Pflanzenarchitektur, die durch den modularen Aufbau des Sprosses ermöglicht werden. In den Blattachseln des Primärsprosses werden Achselknospen angelegt. Jede einzelne dieser Knospen hat das Potenzial, zu einem Sekundärspross, d.h. einem Zweig, auszuwachsen. Der Knospenaustrieb wird jedoch reguliert und die meisten Knospen verbleiben in einem dormanten Status. Bei der Entscheidung, ob die Dormanz einer Knospe gebrochen wird und sie zu einem Zweig auswächst, spielen diverse endo- und exogene Faktoren eine Rolle, die in einem komplexen, aus Hormonen und Transkriptionsfaktoren bestehenden Regelnetz, integriert werden. Dieses umfasst Strigolactone (SL), eine neuartige Klasse von Phytohormonen, die im Allgemeinen den Knospenaustrieb hemmen. Es wird diskutiert, dass der inhibitorische Effekt der SL durch eine Modulation des Flusses des Phytohormons Auxin und/oder die Regulation anderer nachgelagerter Faktoren direkt in der Knospe herbeigeführt wird. Das bekannteste Beispiel für ein knospenspezifisches, SL-reguliertes Gen ist BRANCHED1 (BRC1), dessen mRNA-Abundanz positiv von SL beeinflusst wird. Es codiert einen Transkriptionsfaktor der den Knospenaustrieb unterdrückt, was höchstwahrscheinlich über eine Regulation des Zellzyklus erfolgt. SL und BRC1 wurden umfassend in Modellarten wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Erbse (Pisum sativum), Petunie (Petunia hybrida) und Reis (Oryza sativa) untersucht. Im Gegensatz dazu ist das Wissen über die Gene und Stoffwechselwege dieses Regelkreises in verholzten, ausdauernden Arten wie dem Modellbaum Pappel (Populus sp.), limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden Pappel-Orthologe von Genen, die an der SL-Biosynthese (MAX4) und der SL-Signaltransduktion (MAX2) beteiligt sind, identifiziert und auf eine vermutete Funktion in der Regulation der Baumarchitektur untersucht. Es existieren jeweils zwei Orthologe in der Pappel. Um ihre Funktion zu charakterisieren, wurden Expressionsanalysen durchgeführt und transgene Linien für amiRNA-vermittelte simultane oder einzelne knock-downs der beiden Orthologe erzeugt. Knock-downs von MAX2 waren nur teilweise erfolgreich. Es konnte kein Phänotyp beobachtet werden, was höchstwahrscheinlich auf eine redundante Funktion des nicht herunterregulierten Orthologs zurückzuführen ist. MAX4 Doppel-Knock-downs waren hingegen erfolgreich und es konnten typische SL-Mangelphänotypen in den entsprechenden amiMAX4-1+2 Linien beobachtet werden. Diese umfassten eine erhöhte Sprossverzweigung, eine Reduktion der Pflanzenhöhe, eine verkürzte Indernodienlänge sowie eine erhöhte Adventivbewurzelung. Durch ihre geringe Konzentration, hohe Instabilität und große Diversität ist die direkte Quantifizierung von SL sehr anspruchsvoll. Außerdem sind Standards und Referenzen für Pappel-SL nicht verfügbar, was direkte Messungen nicht durchführbar machte. Stattdessen wurden indirekte Hinweise auf SL-Mangel in den amiMAX4-1+2 Pflanzen gesammelt. Ein Beispiel dafür ist die erfolgreiche Komplementation der Sprossphänotypen durch Pfropfung. Baumspezifische Aspekte der Knospendormanz, besonders die Winterdormanz, wurden ebenfalls untersucht. Ein Einfluss von SL konnte aber nicht nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass SL den Knospenaustrieb nur in der vegetativen Periode hemmen. Als ein SL-reguliertes Zielgen und daher eine weitere wichtige Komponente der Verzweigungskontrolle wurde ein Pappel BRC1 Ortholog identifiziert. Dieses Gen wies die typischen, in anderen Arten nachgewiesenen Expressionsmuster, sowie eine signifikant reduzierte Expression in den erzeugten amiMAX4-1+2 Linien auf, welche wahrscheinlich reduzierte SL-Level haben. Zusätzlich wurde auf der Basis von Sequenz- und Expressionsanalysen ein Pappel BRC2 Ortholog identifiziert. Beide Gene kontrollieren möglicherweise die Verzweigung in Pappeln und integrieren verschiedene Umwelteinflüsse. Zusammengefasst legen die in diesem Projekt gewonnenen Daten eine Rolle von SL und BRC1 als wichtige Regulatoren des Knospenaustriebs in Pappeln nahe. Die Ergebnisse machen deutlich, dass grundlegende Prozesse in der Kontrolle der Pflanzenarchitektur über ein breites Spektrum von Arten, einschließlich Bäumen, hoch konserviert sind. Abgesehen von ihrer Relevanz als Grundlage zur Erforschung der Rolle von SL und BRC1 in Pappeln, sind die in diesem Projekt erzeugten stark verzweigten Linien möglicherweise wirtschaftlich für die Nutzung auf Kurzumtriebsplantagen interessant, auf welchen sie vermutlich über verbesserte Eigenschaften im Stockaustrieb nach der Ernte und im Kronenschluss verfügen.