Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Loiana Noronha (loiaunb@hotmail.com) on 2010-03-17T14:35:56Z No. of bitstreams: 1 2008_RogerioCBarrosoBrito.pdf: 4410578 bytes, checksum: 4cdbd123ef2ef1e5d381ac41d5141afc (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-05-19T18:41:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RogerioCBarrosoBrito.pdf: 4410578 bytes, checksum: 4cdbd123ef2ef1e5d381ac41d5141afc (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-19T18:41:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RogerioCBarrosoBrito.pdf: 4410578 bytes, checksum: 4cdbd123ef2ef1e5d381ac41d5141afc (MD5) Previous issue date: 2008-04 / O objetivo do presente trabalho foi avaliar a viabilidade de folículos primordiais suínos após período de hipotermia com ou sem cultivo in vitro. A baixa temperatura tem sido usada para reduzir o metabolismo celular e minimizar a degradação tecidual. Foram utilizados 4 ovários de 4 animais prépúberes oriundos de abatedouro. Como controle, pedaços de córtex ovariano foram fixados no abatedouro (Controle Abate) e no momento em que chegaram ao laboratório (Controle Lab). Como controle do cultivo, pedaços de córtex foram destinados ao cultivo in vitro assim que chegaram ao laboratório (Controle CIV). Os ovários foram transportados ao laboratório a 36-38ºC em no máximo 1 hora. No laboratório, pedaços de córtex ovariano foram dissecados e mantidos em solução salina estéril a 4ºC ou 20ºC por 6, 12 ou 18hs. Após o resfriamento de todas as amostras, em cada tratamento houve um fragmento do córtex que foi fixado e outro que foi submetido ao cultivo in vitro por duas horas e então fixado posteriormente. O cultivo in vitro foi realizado utilizando meio Waymouth suplementado com piruvato, glutamina, ITS, ácido ascórbico, antibióticos e soro fetal bovino, a 38ºC em atmosfera umidificada com 5% de CO2 em ar. A finalidade do cultivo in vitro de curta duração foi somente restabelecer a temperatura e o metabolismo celular, não havendo a intenção de promover crescimento, para que as células pudessem expressar morfologicamente possíveis danos moleculares que tenham sofrido durante o tratamento. Após a fixação, todas as amostras foram preparadas para histologia. Somente os folículos primordiais foram contados e classificados como morfologicamente normais (FMN) ou degenerados. Os tratamentos foram comparados entre si por ANOVA e teste de Scheffe’s. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os tratamentos (P>0,05) sob análise de microscopia de luz. É possível preservar ovários suínos a 4ºC ou 20ºC por até 18h, mantendo alta porcentagem de folículos primordiais morfologicamente normais (FMN). Na maioria dos tratamentos pode ser notada uma tendência em aumentar a percentagem de FMN quando o cultivo in vitro foi realizado. O cultivo in vitro não mostrou danos submorfológicos que poderiam ter sido causados durante o período de resfriamento. Os resultados ultra-estruturais mostram que folículos primordiais em tecido ovariano mantido a 4ºC ou 20ºC por 18hs não apresentaram alterações ultra-estruturais que comprometessem sua viabilidade. Além disso, os tratamentos cultivados in vitro por 2h proporcionaram uma melhor integridade celular dos folículos primordiais suínos. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of the present study was to evaluate the viability of pig primordial follicles after low temperature maintenance. Four ovaries from 4 gilts collected at a local slaughterhouse were used. As controls, samples of ovarian cortex were fixed at the slaughterhouse (slaughter control) an as soon as they got to the laboratory (LAB control). Also, fresh cortex samples were placed in in vitro culture (CIV control). The ovaries were transported to the Lab at 36-38ºC within 1 hour. In the Lab, samples of ovarian cortex were dissected and maintained in sterile saline solution at 4 ºC or 20 ºC for 6h, 12h or 18h. After the incubation time of all treatments, one sample of each treatment was fixed and another was placed in in vitro culture for 2h and than fixed. The in vitro culture was performed using Waymouth medium supplemented with pyruvic acid, glutamine, ITS, ascorbic acid, antibiotics and fetal calf serum, at 38 ºC inhumidified atmosphere with 5% CO2 in air. The aim of this short in vitro culture was only return the tissues to their normal temperature and metabolism (there was no intention to promote growth). This way, the cells could morphologically express molecular damage that could have occurred during the cooling. After fixation, all samples were processed for histology. Only primordial follicles were counted and classified as morphologically normal (FMN) or degenerated. Treatments were compared among each other using ANOVA and Scheffe’s test. No significant difference was observed among treatments (P>0.05) under the light microscopy analysis. It is possible to preserve pig ovaries at 4ºC or 20ºC for up to 18h, keeping a high percentage of morphologically normal primordial follicles. The most treatments a tendency to improve the percentage of FMN could be noted when in vitro culture was performed. The in vitro culture did not show submorphological damage that could be caused during low temperature preservation. Our results ultrastructural indicate that the treatments in vitro cultured for 2h showed better conditions viability and cellular integrity of pig primordial follicles.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-27T14:45:10Z No. of bitstreams: 1 2013_DanielaCarrilho.pdf: 17965335 bytes, checksum: 9b760530fd0f19c7894da14867384ff6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-28T11:26:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DanielaCarrilho.pdf: 17965335 bytes, checksum: 9b760530fd0f19c7894da14867384ff6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-28T11:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DanielaCarrilho.pdf: 17965335 bytes, checksum: 9b760530fd0f19c7894da14867384ff6 (MD5) / Os avanços nas tecnologias reprodutivas têm aumentado o aproveitamento do material genético de animais de interesse zootécnico ou ameaçados de extinção. A criopreservação de ovócitos imaturos inclusos no tecido ovariano é uma alternativa para a preservação de diversas espécies, particularmente em suínos, visto que ovócitos maduros desse grupo são extremamente sensíveis a baixas temperaturas. A escolha da técnica de criopreservação (congelamento lento ou vitrificação) interfere na eficiência de preservação do material, por isso, são necessários estudos que visem o desenvolvimento de protocolos de conservação das células germinativas inclusas em folículos pré-antrais (FPA) suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar o efeito de técnicas de criopreservação, congelamento lento e vitrificação, na morfologia de FPA inclusos no tecido ovariano de suínos. Os fragmentos do tecido ovariano foram submetidos a dois protocolos de vitrificação (V1 e V2) e um de congelamento lento (CL), vitrificados em superfície sólida ou congelados em um freezer programável. Na V1, os fragmentos foram imersos em uma solução de equilíbrio (SE) de DMSO 1,0 M e uma solução de vitrificação (SV) de DMSO 2,0 M + acetamida 1,0 M + propanodiol 3,0 M. Para a V2, utilizou-se SE contendo etilenoglicol 0,6 M e SV contendo etilenoglicol 5,6 M + polivinilpirrolidona 0,45 M e 13,7% sacarose. Para o CL, os fragmentos foram colocados em criotubos com solução de etilenoglicol 1,5 M e 0,4% sacarose. As amostras foram congeladas pelo método lento ou vitrificadas em superfície sólida e todos os fragmentos foram armazenados em nitrogênio líquido. Após o reaquecimento ou descongelamento, as amostras foram fixadas e processadas para microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os dados das porcentagens de folículos morfologicamente normais (FMN) foram submetidos ao teste de Tukey. As médias de FMN foram 97,1±2,6 para o controle, 96,1± 3,0 para a V1, 81,1±14,8 para a V2 e 86,7±7,3 para o CL. As porcentagens de FMN no CL e na V2 foram estatisticamente menores (P<0,05) que a do controle e a da V1, a qual por sua vez foi estatisticamente igual ao controle. Para a análise ultraestrutural, foram avaliados apenas FPA caracterizados como morfologicamente normais nos cortes semi-finos, e somente dos melhores tratamentos. A ultraestrutura celular de FPA criopreservados pelo método V1 apresentou vários sinais de degeneração, enquanto FPA congelados pela técnica CL apresentaram morfologia normal, semelhante ao controle. Em conclusão, a técnica de CL foi mais eficiente para preservar folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano de suínos, entretanto o aperfeiçoamento da técnica de vitrificação para tecido ovariano suíno ainda é necessário. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Advances in reproductive technologies have increased the use of genetic material from animals of zootechnical interest or endangered species. Cryopreservation of oocytes enclosed in ovarian tissue is an alternative for preservation of many species, particularly pigs, since mature oocytes of this group are extremely sensitive to low temperatures. The choice of technique for cryopreservation (slow freezing or vitrification) interferes with the efficiency of preservation of the material, thus, studies are needed for the development of protocols for conservation of germ cells enclosed in preantral follicles (PAF) of pigs. The aim of our study was to compare the effect of cryopreservation techniques, slow freezing and vitrification, on morphology of PAF included in the ovarian tissue of pigs. The fragments of ovarian tissue were submitted to two vitrification protocols (V1 and V2) and one slow freezing (SF) protocol, vitrified on solid surface or frozen in a programmable freezer. In V1, fragments were immersed in an equilibrium solution (ES) of DMSO 1.0 M and a vitrification solution (VS) of DMSO 2.0 M + acetamide 1.0 M + propanediol 3.0 M. For V2, ES contained 0.6 M and VS contained ethylene glycol 5.6 M + polyvinylpyrrolidone 0.45 M and 13.7% sucrose. For the SF, fragments were placed in cryotubes with solution of 1.5 M ethylene glycol and 0.4% sucrose. Samples were slow cooled or vitrified by solid surface vitrification and all fragments were stored in liquid nitrogen. After reheating or defrosting, samples were fixed and processed for light microscopy and transmission electron microscopy. Data for the percentage of morphologically normal follicles (MNF) were subjected to Tukey's test. Mean MNF were 97.1±2.6 for control, 96.1±3.0 for V1, 81,1± 14,8 for V2 and 86,7± 7,3 for SF. The percentages of MNF in SF and in V2 were lower (P <0.05) than in the control and in V1, which was statistically equal to control. For ultrastructural analysis, were evaluated only PAF characterized as morphologically normal in the semithin sections and only the best treatments. The cellular ultrastructure of PAF cryopreserved by V1 method showed various signs of degeneration, while PAF frozen by SF technique showed normal morphology, similar to control. In conclusion, the SF technique was more efficient to preserve preantral follicles enclosed in ovarian tissue of pigs; however, the improvement of vitrification technique for porcine ovarian tissue is still needed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-05-06T20:46:13Z No. of bitstreams: 1 2009_JulianaCaldasPereiraPlacido.pdf: 3989310 bytes, checksum: 1dfc9dd1cf8950992a8543753fbc774b (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-07T21:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_JulianaCaldasPereiraPlacido.pdf: 3989310 bytes, checksum: 1dfc9dd1cf8950992a8543753fbc774b (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-07T21:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_JulianaCaldasPereiraPlacido.pdf: 3989310 bytes, checksum: 1dfc9dd1cf8950992a8543753fbc774b (MD5) Previous issue date: 2009-02-16 / O objetivo deste trabalho foi testar o efeito do resfriamento seguido da criopreservação do tecido ovariano na morfologia e ultraestrutura dos folículos préantrais suínos. Ovários de 7 porcas foram coletadas em abatedouro local. De cada ovário foram retiradas 4 finas fatias do córtex (~ 1cm2) e uma fatia foi imediatamente fixada em Carnoy (grupo controle-C.A.). As amostras foram colocadas em PBS e mantidas a 4oC por 18 horas. Após isto, uma amostra foi fixada (grupo resfriamento-RESFRI.). As outras duas amostras foram criopreservadas em 1.5 M de EG com 0.4% de sacarose em tampão PBS. Após 7 dias, as amostras foram descongeladas e o crioprotetor removido. Então, uma das amostras foi fixada (grupo criopreservação-CRIO) e as outras amostras foram colocadas em cultivo in vitro (grupo CRIOCIV) por 2h juntamente com amostras frescas de tecido ovariano (grupo controle cultivo-CCIV), e então fixadas. Para análise histológica as amostras foram desidratadas em álcool, clarificados com xileno e embebidos em parafina. Secções (5μm) foram coradas com hematoxilinaeosina (HE) e analisadas por microscopia de luz (ML). As amostras também foram processadas para microscopia eletrônica de transmissão (MET). A porcentagem de folículos morfologicamente normais (FMN) foi comparada entre os tratamentos por ANOVA e Teste de Tukey. Na análise histológica, os folículos pré-antrais do resfriamento, criopreservação e cultivo in vitro apresentaram morfologia similar ao do controle. A grande maioria dos folículos demonstrou aparência normal. A porcentagem de FMN nos grupos C.A., RESFRI, CRIO, CRIO- CIV e CCIV foram respectivamente: 839, 819, 839, 7310 e 874. Não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos (P>0,05). A análise por MET, entretanto, mostrou danos irreversíveis às organelas dos folículos pré-antrais criopreservados após 18 horas de resfriamento. Os principais danos observados foram alteração na granulação do citoplasma do oócito, ruptura da membrana nuclear, inchaço das mitocôndrias com perda das cristas, desorganização das células da granulosa e descolamento destas do oócito. Em conclusão, a associação do resfriamento e criopreservação do tecido ovariano não preserva a ultraestrutura dos folículos pré-antrais suínos. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this work was to test the effect of cooling followed by freezing of ovarian tissue on the morphology and ultrastructure of pig preantral follicles. Ovaries from 7 gilts were collected at a local slaughterhouse. From each ovary 4 slim slices of cortex (~1cm2) were cut, and 1 slice was immediately fixed in Carnoy fixative (Control Group C.A). Samples were placed in PBS and kept at 4oC for 18 hours. After that, one sample was fixed (Chilling Group - RESFRI). The other two samples were cryopreserved in 1.5M of EG with 0.4% sucrose in PBS. After 7 days, samples were thawed and cryoprotectant was removed. Then, one of the samples was fixed (Cryopreservation Group - CRIO) and the other sample was placed in in vitro culture (Cryopreservation-CIV Group - CRIO-CIV) for 2h, together with fresh ovarian tissue samples (CIV Control Group - CCIV), and then fixed. For histological analysis samples were dehydrated in alcohol, clarified with xylene and imbedded in paraffin wax. Sections (5μm) were stained with hematoxilineosin (HE) and analyzed by light microscopy (ML). Samples were also processed for transmission electron microscopy (TEM). The percentage of morphologically normal follicles (MNF) was compared among treatments by ANOVA and Tukey test. The percentages of MNF observed under light microscopy in C.A., RESFRI, CRIO, CRIO-CIV and CCIV treatments were respectively: 839, 819, 839, 7310 e 874. No statistical difference was observed among treatments (P>0.05). The analysis by TEM, however, showed irreversible damage to the oocyte organelles of preantral follicles cryopreserved after 18 hours of cooling. Damages as alteration in granulation of ooplasm, nuclear membrane rupture, swollen mitochondria, disorganization of granulosa cells and detachment from oocyte. In conclusion, the association of colling and freezing of ovarian tissue did not preserve the ultrastructure of pig ovarian preantral follicles.