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Untersuchung der submitochondrialen Verteilung von Oxa1 und Mba1 in Saccharomyces cerevisiae / Analysis of the submitochondrial distribution of Oxa1 and Mba1 in Saccharomyces cerevisiaeStäglich, Marlen Marina 15 October 2015 (has links)
Die Mitochondrien eukaryotischer Zellen sind an einer Reihe zellulärer Prozesse beteiligt und übernehmen essentielle Funktionen, wie die der Energiegewinnung aus der oxidativen Phosphorylierung. Sie weisen ein hohes Maß an struktureller Komplexität auf. Das gesamte Organell wird von der äußeren mitochondrialen Membran umgeben und ist durch diese gegenüber dem Zytoplasma abgegrenzt. Die innere mitochondriale Membran kann morphologisch in zwei Bereiche unterteilt werden: Der der äußeren Membran direkt gegenüberliegende Teil wird als „innere Grenzflächenmembran“ bezeichnet, während zahlreiche Einstülpungen die sogenannte „Cristaemembran“ bilden.
Vorhergehende Studien lieferten Hinweise darauf, dass es sich bei der Subkompartimentierung der Innenmembran auch um eine funktionale Gliederung handeln könnte, da für zahlreiche mitochondriale Proteine eine heterogene Verteilung nachgewiesen werden konnte. Darunter befindet sich auch das Protein Oxa1 der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, das sowohl bei der Insertion von kernkodierten als auch von mitochondrial kodierten Proteinen eine zentrale Rolle spielt. In vorausgegangenen Arbeiten wurde belegt, dass Oxa1 bevorzugt in der inneren Grenzflächenmembran vorliegt, wenn die Hefen mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wachsen. Diese Verteilung ist jedoch dynamisch und verändert sich in Abhängigkeit von den physiologischen Bedürfnissen der Zellen. Wachsen die Hefen mit einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle, weist Oxa1 eine präferentielle Lokalisation in der Cristaemembran auf. Eine Anreicherung in der Cristaemembran ist auch zu beobachten, wenn die hoch konservierte Aminosäure Tryptophan an Position 128 mit Phenylalanin substituiert wird. Die Substitutionsmutation oxa1-W128F führt darüber hinaus zu einer Verringerung der durchschnittlichen Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe. Hieraus ergab sich die Frage, ob die Komplexgröße und die submitochondriale Lokalisation von Oxa1 in direktem Zusammenhang stehen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe in Abhängigkeit zu der zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle untersucht. Es zeigte sich jedoch, dass die durchschnittlichen Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe, die in der inneren Grenzflächenmembran angereichert sind, ungefähr den Größen der Komplexe entsprechen, die bevorzugt in der Cristaemembran vorliegen. Demzufolge gibt es keinen Zusammenhang zwischen der Komplexgröße und der Lokalisation von Oxa1, weshalb der Veränderung der Lokalisation ein anderer Mechanismus zu Grunde liegen muss. Die Untersuchung der Variante Oxa1-W128F zeigte, dass diese im Vergleich zu Oxa1, wie bereits beschrieben, in kleineren Komplexen vorliegt, bei denen es sich sogar um Dimere sowie Tetramere von Oxa1 handeln könnte, und, dass die Verringerung der Komplexgrößen auf eine beeinträchtigte Homooligomerisierung zurückgeführt werden kann. Zusammen mit der Tatsache, dass neben Oxa1 selbst keine weiteren Interaktionspartner identifiziert werden konnten, legen diese Ergebnisse nahe, dass Oxa1 sowohl unter fermentativen als auch respiratorischen Bedingungen in größeren homooligomeren Komplexen agieren könnte und, dass seine Dynamik möglicherweise auf transiente Interaktionen mit Substraten zurückzuführen ist.
Es ist bekannt, dass in S. cerevisiae neben Oxa1 noch weitere Proteine existieren, die ebenfalls Teil der Proteininsertionsmaschinerie der inneren mitochondrialen Membran sind. Dazu gehören Pnt1 und Mba1, über deren Verteilung in der inneren Membran bisher keine gesicherten Erkenntnisse vorlagen. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich heraus, dass auch Pnt1 und Mba1 heterogen verteilt sind. So ist sowohl für Pnt1 als auch für Mba1 bei Wachstum mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle eine Anreicherung in der inneren Grenzflächenmembran zu verzeichnen. Bei Wachstum mit einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle verschiebt sich die präferentielle Lokalisation von Pnt1 zu einer Anreicherung in der Cristaemembran, wie es bereits für Oxa1 beobachtet wurde. Mba1 hingegen liegt unverändert bevorzugt in der inneren Grenzflächenmembran vor. Somit konnte für die heterogene Verteilung von Pnt1 eine von den physiologischen Bedingungen abhängige Dynamik und für die heterogene Verteilung von Mba1 eine Statik nachgewiesen werden.
Auf Grund des differenzierten Lokalisationsverhaltens von Mba1 im Vergleich zu Oxa1 und Pnt1, wurde eine nähere Charakterisierung der submitochondrialen Verteilung von Mba1 vorgenommen. Bei der Untersuchung der Ursachen der statischen Lokalisation von Mba1 auf molekularer Ebene, wurde festgestellt, dass bereits die Deletion von nur fünf Aminosäuren (mba1 1-273) sowie die Substitution einer einzelnen Aminosäure (mba1-I272A) im C-Terminus von Mba1 zu einer drastischen Veränderung der heterogenen Mba1-Verteilung führt. Die Untersuchung der Auswirkungen der Genmutationen auf die Funktion von Mba1 zeigte, dass es infolge der Deletionsmutation zu einer verminderten Respirationskompetenz der Zellen kommt, die auf eine Beeinträchtigung der Assemblierung eines Superkomplexes der Atmungskette (2 x KomplexIII / 2 x KomplexIV) zurückgeführt werden kann. Somit liefert die vorliegende Arbeit erstmals Hinweise darauf, dass die dokumentierte heterogene und statische Verteilung von Mba1 in der inneren Membran ausschlaggebend für die korrekte Funktionsweise von Mba1 ist. Möglicherweise wird der Funktionsort von Mba1 durch die Bindung eines bisher nicht eindeutig identifizierten Interaktionspartners bestimmt.
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Organisation sous-mitochondriale de l'aspartyl-ARNt synthétase humaine et implication dans le syndrome LBSL / Submitochondrial organization of human mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase and its implication in LBSL diseaseKarim, Loukmane 04 October 2016 (has links)
Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif de contribuer à la compréhension du lien entre l’aspartyl-ARNt synthétase mitochondriale (AspRSmt) humaine et le syndrome LBSL, en étudiant les propriétés de cette enzyme au niveau cellulaire. Les objectifs étaient : 1) d’explorer l’organisation de l’AspRSmt dans la mitochondrie (Chapitre 1), 2) d’identifier la forme mature de l’AspRSmt après son import, ainsi que la localisation sous-mitochondriale de cette enzyme (Chapitre 2), 3) d’évaluer l’impact de quelques mutations, impliquées dans le syndrome LBSL, sur les propriétés de l’AspRSmt (Chapitre 3). Nous avons démontré que l’AspRSmt existe sous différentes formes de produits de maturation, et qu’elle est retrouvée, au moins, dans deux complexes, suggérant potentiellement différents partenaires et/ou fonctions pour cette enzyme. Nous avons établi la localisation sous-mitochondriale de l’AspRSmt, et démontré que cette dernière est doublement localisée avec une fraction soluble et une fraction périphérique interagissant avec la membrane. Nous avons également découvert que, sous certaines conditions de stress, l’AspRSmt est relarguée de la mitochondrie et pourrait avoir un lien avec le processus d’apoptose. En outre, nous avons évalué l’impact de quelques mutations, impliquées dans le syndrome LBSL, et trouvé qu’elles n’ont pas d’effet significatif sur les propriétés de l’AspRSmt. L’ensemble des résultats souligne, d’une part, les lacunes restant à combler concernant les propriétés de l’AspRSmt dans la compréhension du lien mutations/pathologie (LBSL), et d’autre part, suggère fortement l’existence d’une éventuelle fonction non canonique (alternative) de l’AspRSmt. / The aim of the PhD project was to contribute to the understanding of the link between mutations in the human mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase (mt-AspRS) and LBSL disease, by studying the properties of this enzyme at the cellular level. Our objectives were: 1) to explore the organization of mt-AspRS in mitochondria (Chapter 1), 2) to identify the mature form of mt-AspRS after its import, and to characterize its submitochondrial localization (Chapter 2), 3) to assess, in cellulo, the impact of some LBSL-causing mutations on some properties of mt-AspRS (Chapter 3). We showed that mt-AspRS is processed into different mature forms, and that mt-AspRS belongs to two complexes likely suggesting different partners and/or functions. We demonstrated that mt-AspRS is dually localized with soluble and peripherally membrane-associated fractions. We also demonstrated that, under stress conditions, mt-AspRS is released outside mitochondria with a possible link to the apoptosis. Furthermore, we assessed the impact of some LBSL-causing mutation on some cellular properties of mt-AspRS, and showed that most mutations do not have a significant impact. This underscores the need for more studies about mt-AspRS properties, and strongly suggests a potential non-canonical (alternative) function of the enzyme.
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