Atualmente, o setor sucroenergético está se tornando cada vez mais competitivo, o que de fato é incentivado, principalmente, pela representativa demanda e exigências do mercado externo. Ao se analisar a produção do açúcar refinado, podem-se encontrar barreiras para a sua ampla aceitação nacional e internacional devido ao método de clarificação empregado, uma vez que este é realizado através da queima de enxofre elementar em câmaras de combustão. O uso do sulfito acima dos limites permitidos pode ocasionar potenciais problemas de saúde pública. Neste sentido, o Brasil tem realizado estudos sobre a adoção de novas tecnologias para a substituição da sulfitação, sem alteração da qualidade do açúcar refinado a ser produzido. Partindo deste pressuposto, fez-se a avaliação do uso do peróxido de hidrogênio (H2O2) em solução comercial (35% v/v) como reagente alternativo ao dióxido de enxofre para obtenção de açúcar refinado com menor cor ICUMSA. Para isso, na calda de açúcar do tipo VHP, foram testadas doses distintas de peróxido de hidrogênio, aliadas a diferentes pH e temperaturas frente a um Delineamento composto central composto central, permitindo a otimização e o acompanhamento das transformações decorrentes do processo. Com isso, obteve-se como melhores condições o pH 7,5 e 10, temperaturas entre 50 e 70 °C e dosagens entre 500 e 797,6 ppm de H2O2. A análise a partir da cinética química da peroxidação da calda permitiu observar maiores reduções da cor ICUMSA em geral nos tempos de 50 a 75 minutos e nos 30 primeiros minutos para os pontos extremos de pH, temperatura e dose de H2O2. A degradação de sacarose não foi um fator expressivo quanto ao tempo, pois a mesma na maioria dos casos foi degradada nos 5 primeiros minutos e após esse tempo se mantinha sem muitas alterações, sendo mais vulnerável as condições de pH 3,32 e 11,68, altas temperaturas (83,6 °C) e máxima dosagem H2O2 (1000 ppm) aplicados. Além de favorecer a redução da cor ICUMSA da calda, o H2O2 também se mostrou como um bom agente antimicrobiano, principalmente quando associado às altas temperaturas. Agindo com maior intensidade na diminuição da carga bactériana do que na diminuição da carga fungica. A rede neural artificial (RNA) mostrou um bom ajuste e indicou a variável °Brix (teor de sólidos solúveis) como a que apresentou maior influência na redução da cor ICUMSA e a variável tempo a que menor influenciou na redução de cor. / Nowadays, the sugar-energy industry is becoming increasingly competitive, which indeed is encouraged mainly by representative demand and requirements of foreign markets. When analyzing the production of refined sugar can be found barriers to their widespread international acceptance due to the clarification method employed, since this is performed by burning elemental sulfur in combustion boilers. The use of sulfite above the permitted limits can result in potential public health problems. In this regard, Brazil has conducted studies on the adoption of new technologies to replace the sulfite, without changing the quality of the produced refined sugar. On that basis, it was done the evaluation of the use of hydrogen peroxide (H2O2) in commercial solution (35% v/v) as an alternative reagent to sulfur dioxide to obtain refined sugar with less ICUMSA color. For this the sugar liquor VHP different doses of hydrogen peroxide were tested, together with different pH and temperatures outside a central composite design, enabling optimization and monitoring of changes resulting from the process. Thus there was obtained as the best pH conditions 7.5 to 10, temperatures between 50 and 70 °C and dosages between 500 and 797.6 ppm H2O2. The analysis from the chemical kinetics of the peroxidation of the liquor has observed greater reductions in ICUMSA color in general in the time of 50 minutes to 75 minutes and in the first 25 minutes to the extremes of pH, temperature and H2O2 dose. As for sucrose degradation was not a significant factor, since it in most cases was first degraded within 5 minutes and after this time remained without many changes, being more vulnerable conditions (3.32 and 11.68), high temperatures (83.6 °C) and H2O2 maximum dosage (1000 ppm) applied. In addition to further reduce color ICUMSA H2O2 Liquor also showed such a good antimicrobial agent, particularly when combined with high temperatures. Acting with more intensity in the decrease of bacteria than the reduction of fungi. The artificial neural network (ANN) showed good fit and indicated the variable ° Brix (soluble solids) as the one with the greatest influence in reducing the ICUMSA color and variable time that less influenced the color reduction.

A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

O sulfito e o tiossulfato estão acumulados em tecidos e líquidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da sulfito oxidase (SO), uma enzima mitocondrial que catalisa a oxidação de sulfito derivado do metabolismo de aminoácidos sulfurados. A deficiência da SO é causada pela deficiência isolada da enzima SO ou por uma deficiência na rota de biossíntese de seu cofator molibdênio. Os indivíduos afetados por esta desordem apresentam disfunção neurológica progressiva, convulsões neonatais severas, subluxação do cristalino, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento, resultando geralmente em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico encontrado em pacientes deficientes para a SO ainda não está esclarecida, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre parâmetros de metabolismo energético e homeostase redox e mitocondrial em cérebro de ratos jovens. Inicialmente, verificamos que o sulfito inibe a atividade do complexo IV da cadeia respiratória, indicando que este composto prejudica o fluxo de elétrons, enquanto que o tiossulfato não afetou a atividade de nenhum dos complexos da cadeia respiratória em sobrenadantes de córtex cerebral. Também foi verificado que o sulfito e o tiossulfato diminuem a atividade da creatina quinase total (tCK) e de suas isoformas mitocondrial e citosólica, sugerindo que estes compostos prejudicam o tamponamento e a transferência de energia celular no cérebro. Além disso, melatonina, trolox (análogo solúvel do α-tocoferol), glutationa e o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metil éster atenuaram ou preveniram totalmente a inibição da tCK induzida por sulfito e tiossulfato, sugerindo o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nestes efeitos. O sulfito e o tiossulfato também aumentaram a oxidação da 2’,7’-diclorofluorescina e inibiram a atividade da aconitase, enquanto que somente o sulfito aumentou a produção de peróxido de hidrogênio, reforçando o envolvimento de dano oxidativo nos efeitos provocados por estes metabólitos. Contudo, a atividade da enzima Na+,K+-ATPase sináptica não foi alterada pelo sulfito e tiossulfato. Em seguida, observamos que o sulfito dissipa o potencial de membrana mitocondrial na presença de Ca2+, de forma dose-dependente de sulfito e Ca2+ em preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O sulfito também induziu inchamento e diminuiu a capacidade de retenção de Ca2+, os níveis de NAD(P)H na matriz e o imunoconteúdo de citocromo c em mitocôndrias quando Ca2+ estava presente no meio. Além disso, as alterações provocadas pelo sulfito foram prevenidas por rutênio vermelho, ciclosporina A e ADP, sugerindo que o sulfito induz transição da permeabilidade mitocondrial (MPT). Também foi verificado que dentre vários inibidores da MPT, incluindo antioxidantes, inibidores da fosfolipase A2 e o regente redutor ditiotreitol, apenas o agente alquilante de tióis N-etilmaleimida foi capaz de prevenir o inchamento mitocondrial causado por sulfito. O sulfito também diminuiu o conteúdo de grupamentos tiol de proteínas de membrana em preparações mitocondriais de cérebro, indicando que este composto age diretamente sobre grupamentos tiol contidos no poro de MPT. Assim, pode-se presumir que o prejuízo no metabolismo energético e na homeostase redox causados pelo sulfito e pelo tiossulfato e que a indução de MPT pelo sulfito podem estar envolvidos na disfunção neurológica observada nos portadores da deficiência da SO. / Sulfite and thiosulfate accumulate in tissues and biological fluids of patients affected by the deficiency of sulfite oxidase (SO), which is a mitochondrial enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite derived from the metabolism of sulfur amino acids. SO deficiency is caused by the isolated deficiency of the enzyme SO itself or by a deficiency in the biosynthetic pathway of its molybdenum cofactor. Individuals affected by this disorder present progressive neurological dysfunction, severe neonatal seizures, lens subluxation, axial hypotonia, limb hypertonicity and failure to thrive, resulting often in early childhood death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage found in SO deficient patients has not been totally established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of sulfite and thiosulfate on parameters of energy metabolism, as well as redox and mitochondrial homeostasis in rat brain. First, we verified that sulfite inhibited the activity of complex IV of the respiratory chain in cerebral cortex supernatants, indicating that this compound impairs the electron transfer flow, whereas thiosulfate did not affect any of the activities of the respiratory chain complexes. It was also found that sulfite and thiosulfate markedly decreased the activity of total creatine kinase (tCK) and its mitochondrial and cytosolic isoforms, suggesting that these compounds impair brain cellular energy buffering and transfer. Moreover, melatonin, trolox (soluble analogue of α-tocopherol), glutathione and the nitric oxide synthase inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester attenuated or fully prevented the inhibition of tCK induced by sulfite and thiosulfate, suggesting the involvement of reactive oxygen and nitrogen species in these effects. Sulfite and thiosulfate also increased 2’,7’-dichlorofluorescin oxidation and inhibited the activity of aconitase, whereas only sulfite increased hydrogen peroxide production, reinforcing the involvement of oxidative damage in the effects elicited by these metabolites. In contrast, synaptic Na+,K+-ATPase activity was not altered by sulfite and thiosulfate. Next, we observed that sulfite dissipates mitochondria membrane potential in the presence of Ca2+, in a sulfite and Ca2+ dose-dependent manner. Sulfite also induced swelling and decreased Ca2+ retention capacity, matrix NAD(P)H pool and cytochrome c immunocontent in mitochondria when Ca2+ was present in the medium. Furthermore, the alterations elicited by sulfite were prevented by ruthenium red, cyclosporine A and ADP, supporting the involvement of mitochondrial permeability transition (MPT) in these effects. It was also verified that among various MPT inhibitors, including antioxidants, phospholipase A2 inhibitors and the reductant reagent dithiothreitol, only the thiol alkylating agent N-ethylmaleimide was able to prevent the sulfite-elicited mitochondrial swelling. Moreover, sulfite decreased membrane protein thiol group content in brain mitochondria, indicating that this compound acts directly on MPT pore containing thiol groups. Taken together, it may be presumed that the mitochondrial energy and redox homeostasis impairment caused by sulfite and thiosulfate and MPT induced by sulfite may be involved in the neurological dysfunction observed in patients affected by SO deficiency.

A deficiência de sulfito oxidase é uma doença autossômica recessiva que afeta o metabolismo da metionina e cisteína. Os indivíduos afetados comumente apresentam, no período neonatal, convulsões refratárias, retardo mental e desordens do movimento cuja fisiopatologia é desconhecida. Os distúrbios no desenvolvimento e o dano cerebral podem ocorrer como resultado do acúmulo tecidual de sulfito no cérebro. Os objetivos deste estudo foram verificar os efeitos in vitro e in vivo do sulfito sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (avaliação de lipoperoxidação e capacidade antioxidante tecidual) e sobre a atividade da Na+, K+-ATPase em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos. Primeiramente, verificamos o efeito in vitro do sulfito sobre o estresse oxidativo e a Na+, K+-ATPase em cérebro de ratos de 10 e 60 dias. Posteriormente, nos estudos in vivo, investigamos o efeito da administração intracerebroventricular de sulfito sobre os parâmetros estudados in vitro. Os estudos in vitro demonstraram uma ação direta do sulfito (500μM) na indução de estresse oxidativo verificada pela redução na atividade da catalase e aumento da peroxidação lipídica, enquanto que nos estudos in vivo o sulfito não alterou a atividade das enzimas antioxidantes, TRAP ou TBARS. Tanto nos estudos in vitro como in vivo, o sulfito mostrou-se incapaz de alterar a atividade da Na+,K+-ATPase. Nossos resultados, em conjunto, não excluem o potencial efeito neurotóxico do sulfito na fisiopatologia da doença. O conhecimento dos níveis deste composto no cérebro pode evidenciar além da condição de estresse oxidativo, o comprometimento de outras vias metabólicas importantes no funcionamento cerebral e podem apontar estratégias terapêuticas na prevenção dos efeitos neurológicos da deficiência de sulfito oxidase. / The sulfite oxidase deficiency is a rare autosomal recessive disorder affecting the metabolism of methionine and cysteine. Affected individuals commonly present in the neonatal period intractable seizures, mental retardation and movement disorder which the physiopathology is unknown. The disturbed development and damage to the brain might occur as a result of tissue accumulation of sulfite in the cerebro. The objectives of this study was to investigate the in vitro and in vivo effects of sulfite on some parameters of oxidative stress (lipoperoxidation and antioxidant capacity) and on Na+, K+-ATPase activity in cerebral cortex, striatum and hippocampus from rats. Firstly, we verified the in vitro effects of sulfite on oxidative stress and Na+, K+- ATPase in brains from 10 and 60 days old rats. In the subsequent events, in the in vitro studies, we investigated the effect of intracerebroventricular injection of sulfite on the same parameters studied in vitro. The in vitro studies showed a direct action of sulfite (500 μM) in the induction of oxidative stress through the decrease of catalase activity and increase of peroxidation lipid, while the in vivo studies didn’t alter the antioxidants enzyme activity, TRAP or TBARS. Both in vitro and in vivo studies, showed that sulfite was incapable to disturb the Na+,K+-ATPase activity. Our results, together, don’t exclude the potencial neurotoxic effect of sulfite in the physiopathology of disease. The kwonledge of levels from this compound in the brain can show over there the oxidative stress, the compromise of others metabolic patways important to the brain function and can to lead to strategies therapeutics in the prevention of neurologic effects on sulfite oxidase deficiency.

A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

A deficiência de sulfito oxidase é uma doença autossômica recessiva que afeta o metabolismo da metionina e cisteína. Os indivíduos afetados comumente apresentam, no período neonatal, convulsões refratárias, retardo mental e desordens do movimento cuja fisiopatologia é desconhecida. Os distúrbios no desenvolvimento e o dano cerebral podem ocorrer como resultado do acúmulo tecidual de sulfito no cérebro. Os objetivos deste estudo foram verificar os efeitos in vitro e in vivo do sulfito sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (avaliação de lipoperoxidação e capacidade antioxidante tecidual) e sobre a atividade da Na+, K+-ATPase em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos. Primeiramente, verificamos o efeito in vitro do sulfito sobre o estresse oxidativo e a Na+, K+-ATPase em cérebro de ratos de 10 e 60 dias. Posteriormente, nos estudos in vivo, investigamos o efeito da administração intracerebroventricular de sulfito sobre os parâmetros estudados in vitro. Os estudos in vitro demonstraram uma ação direta do sulfito (500μM) na indução de estresse oxidativo verificada pela redução na atividade da catalase e aumento da peroxidação lipídica, enquanto que nos estudos in vivo o sulfito não alterou a atividade das enzimas antioxidantes, TRAP ou TBARS. Tanto nos estudos in vitro como in vivo, o sulfito mostrou-se incapaz de alterar a atividade da Na+,K+-ATPase. Nossos resultados, em conjunto, não excluem o potencial efeito neurotóxico do sulfito na fisiopatologia da doença. O conhecimento dos níveis deste composto no cérebro pode evidenciar além da condição de estresse oxidativo, o comprometimento de outras vias metabólicas importantes no funcionamento cerebral e podem apontar estratégias terapêuticas na prevenção dos efeitos neurológicos da deficiência de sulfito oxidase. / The sulfite oxidase deficiency is a rare autosomal recessive disorder affecting the metabolism of methionine and cysteine. Affected individuals commonly present in the neonatal period intractable seizures, mental retardation and movement disorder which the physiopathology is unknown. The disturbed development and damage to the brain might occur as a result of tissue accumulation of sulfite in the cerebro. The objectives of this study was to investigate the in vitro and in vivo effects of sulfite on some parameters of oxidative stress (lipoperoxidation and antioxidant capacity) and on Na+, K+-ATPase activity in cerebral cortex, striatum and hippocampus from rats. Firstly, we verified the in vitro effects of sulfite on oxidative stress and Na+, K+- ATPase in brains from 10 and 60 days old rats. In the subsequent events, in the in vitro studies, we investigated the effect of intracerebroventricular injection of sulfite on the same parameters studied in vitro. The in vitro studies showed a direct action of sulfite (500 μM) in the induction of oxidative stress through the decrease of catalase activity and increase of peroxidation lipid, while the in vivo studies didn’t alter the antioxidants enzyme activity, TRAP or TBARS. Both in vitro and in vivo studies, showed that sulfite was incapable to disturb the Na+,K+-ATPase activity. Our results, together, don’t exclude the potencial neurotoxic effect of sulfite in the physiopathology of disease. The kwonledge of levels from this compound in the brain can show over there the oxidative stress, the compromise of others metabolic patways important to the brain function and can to lead to strategies therapeutics in the prevention of neurologic effects on sulfite oxidase deficiency.

O sulfito e o tiossulfato estão acumulados em tecidos e líquidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da sulfito oxidase (SO), uma enzima mitocondrial que catalisa a oxidação de sulfito derivado do metabolismo de aminoácidos sulfurados. A deficiência da SO é causada pela deficiência isolada da enzima SO ou por uma deficiência na rota de biossíntese de seu cofator molibdênio. Os indivíduos afetados por esta desordem apresentam disfunção neurológica progressiva, convulsões neonatais severas, subluxação do cristalino, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento, resultando geralmente em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico encontrado em pacientes deficientes para a SO ainda não está esclarecida, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre parâmetros de metabolismo energético e homeostase redox e mitocondrial em cérebro de ratos jovens. Inicialmente, verificamos que o sulfito inibe a atividade do complexo IV da cadeia respiratória, indicando que este composto prejudica o fluxo de elétrons, enquanto que o tiossulfato não afetou a atividade de nenhum dos complexos da cadeia respiratória em sobrenadantes de córtex cerebral. Também foi verificado que o sulfito e o tiossulfato diminuem a atividade da creatina quinase total (tCK) e de suas isoformas mitocondrial e citosólica, sugerindo que estes compostos prejudicam o tamponamento e a transferência de energia celular no cérebro. Além disso, melatonina, trolox (análogo solúvel do α-tocoferol), glutationa e o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metil éster atenuaram ou preveniram totalmente a inibição da tCK induzida por sulfito e tiossulfato, sugerindo o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nestes efeitos. O sulfito e o tiossulfato também aumentaram a oxidação da 2’,7’-diclorofluorescina e inibiram a atividade da aconitase, enquanto que somente o sulfito aumentou a produção de peróxido de hidrogênio, reforçando o envolvimento de dano oxidativo nos efeitos provocados por estes metabólitos. Contudo, a atividade da enzima Na+,K+-ATPase sináptica não foi alterada pelo sulfito e tiossulfato. Em seguida, observamos que o sulfito dissipa o potencial de membrana mitocondrial na presença de Ca2+, de forma dose-dependente de sulfito e Ca2+ em preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O sulfito também induziu inchamento e diminuiu a capacidade de retenção de Ca2+, os níveis de NAD(P)H na matriz e o imunoconteúdo de citocromo c em mitocôndrias quando Ca2+ estava presente no meio. Além disso, as alterações provocadas pelo sulfito foram prevenidas por rutênio vermelho, ciclosporina A e ADP, sugerindo que o sulfito induz transição da permeabilidade mitocondrial (MPT). Também foi verificado que dentre vários inibidores da MPT, incluindo antioxidantes, inibidores da fosfolipase A2 e o regente redutor ditiotreitol, apenas o agente alquilante de tióis N-etilmaleimida foi capaz de prevenir o inchamento mitocondrial causado por sulfito. O sulfito também diminuiu o conteúdo de grupamentos tiol de proteínas de membrana em preparações mitocondriais de cérebro, indicando que este composto age diretamente sobre grupamentos tiol contidos no poro de MPT. Assim, pode-se presumir que o prejuízo no metabolismo energético e na homeostase redox causados pelo sulfito e pelo tiossulfato e que a indução de MPT pelo sulfito podem estar envolvidos na disfunção neurológica observada nos portadores da deficiência da SO. / Sulfite and thiosulfate accumulate in tissues and biological fluids of patients affected by the deficiency of sulfite oxidase (SO), which is a mitochondrial enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite derived from the metabolism of sulfur amino acids. SO deficiency is caused by the isolated deficiency of the enzyme SO itself or by a deficiency in the biosynthetic pathway of its molybdenum cofactor. Individuals affected by this disorder present progressive neurological dysfunction, severe neonatal seizures, lens subluxation, axial hypotonia, limb hypertonicity and failure to thrive, resulting often in early childhood death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage found in SO deficient patients has not been totally established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of sulfite and thiosulfate on parameters of energy metabolism, as well as redox and mitochondrial homeostasis in rat brain. First, we verified that sulfite inhibited the activity of complex IV of the respiratory chain in cerebral cortex supernatants, indicating that this compound impairs the electron transfer flow, whereas thiosulfate did not affect any of the activities of the respiratory chain complexes. It was also found that sulfite and thiosulfate markedly decreased the activity of total creatine kinase (tCK) and its mitochondrial and cytosolic isoforms, suggesting that these compounds impair brain cellular energy buffering and transfer. Moreover, melatonin, trolox (soluble analogue of α-tocopherol), glutathione and the nitric oxide synthase inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester attenuated or fully prevented the inhibition of tCK induced by sulfite and thiosulfate, suggesting the involvement of reactive oxygen and nitrogen species in these effects. Sulfite and thiosulfate also increased 2’,7’-dichlorofluorescin oxidation and inhibited the activity of aconitase, whereas only sulfite increased hydrogen peroxide production, reinforcing the involvement of oxidative damage in the effects elicited by these metabolites. In contrast, synaptic Na+,K+-ATPase activity was not altered by sulfite and thiosulfate. Next, we observed that sulfite dissipates mitochondria membrane potential in the presence of Ca2+, in a sulfite and Ca2+ dose-dependent manner. Sulfite also induced swelling and decreased Ca2+ retention capacity, matrix NAD(P)H pool and cytochrome c immunocontent in mitochondria when Ca2+ was present in the medium. Furthermore, the alterations elicited by sulfite were prevented by ruthenium red, cyclosporine A and ADP, supporting the involvement of mitochondrial permeability transition (MPT) in these effects. It was also verified that among various MPT inhibitors, including antioxidants, phospholipase A2 inhibitors and the reductant reagent dithiothreitol, only the thiol alkylating agent N-ethylmaleimide was able to prevent the sulfite-elicited mitochondrial swelling. Moreover, sulfite decreased membrane protein thiol group content in brain mitochondria, indicating that this compound acts directly on MPT pore containing thiol groups. Taken together, it may be presumed that the mitochondrial energy and redox homeostasis impairment caused by sulfite and thiosulfate and MPT induced by sulfite may be involved in the neurological dysfunction observed in patients affected by SO deficiency.

A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

A deficiência de sulfito oxidase é uma doença autossômica recessiva que afeta o metabolismo da metionina e cisteína. Os indivíduos afetados comumente apresentam, no período neonatal, convulsões refratárias, retardo mental e desordens do movimento cuja fisiopatologia é desconhecida. Os distúrbios no desenvolvimento e o dano cerebral podem ocorrer como resultado do acúmulo tecidual de sulfito no cérebro. Os objetivos deste estudo foram verificar os efeitos in vitro e in vivo do sulfito sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (avaliação de lipoperoxidação e capacidade antioxidante tecidual) e sobre a atividade da Na+, K+-ATPase em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos. Primeiramente, verificamos o efeito in vitro do sulfito sobre o estresse oxidativo e a Na+, K+-ATPase em cérebro de ratos de 10 e 60 dias. Posteriormente, nos estudos in vivo, investigamos o efeito da administração intracerebroventricular de sulfito sobre os parâmetros estudados in vitro. Os estudos in vitro demonstraram uma ação direta do sulfito (500μM) na indução de estresse oxidativo verificada pela redução na atividade da catalase e aumento da peroxidação lipídica, enquanto que nos estudos in vivo o sulfito não alterou a atividade das enzimas antioxidantes, TRAP ou TBARS. Tanto nos estudos in vitro como in vivo, o sulfito mostrou-se incapaz de alterar a atividade da Na+,K+-ATPase. Nossos resultados, em conjunto, não excluem o potencial efeito neurotóxico do sulfito na fisiopatologia da doença. O conhecimento dos níveis deste composto no cérebro pode evidenciar além da condição de estresse oxidativo, o comprometimento de outras vias metabólicas importantes no funcionamento cerebral e podem apontar estratégias terapêuticas na prevenção dos efeitos neurológicos da deficiência de sulfito oxidase. / The sulfite oxidase deficiency is a rare autosomal recessive disorder affecting the metabolism of methionine and cysteine. Affected individuals commonly present in the neonatal period intractable seizures, mental retardation and movement disorder which the physiopathology is unknown. The disturbed development and damage to the brain might occur as a result of tissue accumulation of sulfite in the cerebro. The objectives of this study was to investigate the in vitro and in vivo effects of sulfite on some parameters of oxidative stress (lipoperoxidation and antioxidant capacity) and on Na+, K+-ATPase activity in cerebral cortex, striatum and hippocampus from rats. Firstly, we verified the in vitro effects of sulfite on oxidative stress and Na+, K+- ATPase in brains from 10 and 60 days old rats. In the subsequent events, in the in vitro studies, we investigated the effect of intracerebroventricular injection of sulfite on the same parameters studied in vitro. The in vitro studies showed a direct action of sulfite (500 μM) in the induction of oxidative stress through the decrease of catalase activity and increase of peroxidation lipid, while the in vivo studies didn’t alter the antioxidants enzyme activity, TRAP or TBARS. Both in vitro and in vivo studies, showed that sulfite was incapable to disturb the Na+,K+-ATPase activity. Our results, together, don’t exclude the potencial neurotoxic effect of sulfite in the physiopathology of disease. The kwonledge of levels from this compound in the brain can show over there the oxidative stress, the compromise of others metabolic patways important to the brain function and can to lead to strategies therapeutics in the prevention of neurologic effects on sulfite oxidase deficiency.

Atualmente, o setor sucroenergético está se tornando cada vez mais competitivo, o que de fato é incentivado, principalmente, pela representativa demanda e exigências do mercado externo. Ao se analisar a produção do açúcar refinado, podem-se encontrar barreiras para a sua ampla aceitação nacional e internacional devido ao método de clarificação empregado, uma vez que este é realizado através da queima de enxofre elementar em câmaras de combustão. O uso do sulfito acima dos limites permitidos pode ocasionar potenciais problemas de saúde pública. Neste sentido, o Brasil tem realizado estudos sobre a adoção de novas tecnologias para a substituição da sulfitação, sem alteração da qualidade do açúcar refinado a ser produzido. Partindo deste pressuposto, fez-se a avaliação do uso do peróxido de hidrogênio (H2O2) em solução comercial (35% v/v) como reagente alternativo ao dióxido de enxofre para obtenção de açúcar refinado com menor cor ICUMSA. Para isso, na calda de açúcar do tipo VHP, foram testadas doses distintas de peróxido de hidrogênio, aliadas a diferentes pH e temperaturas frente a um Delineamento composto central composto central, permitindo a otimização e o acompanhamento das transformações decorrentes do processo. Com isso, obteve-se como melhores condições o pH 7,5 e 10, temperaturas entre 50 e 70 °C e dosagens entre 500 e 797,6 ppm de H2O2. A análise a partir da cinética química da peroxidação da calda permitiu observar maiores reduções da cor ICUMSA em geral nos tempos de 50 a 75 minutos e nos 30 primeiros minutos para os pontos extremos de pH, temperatura e dose de H2O2. A degradação de sacarose não foi um fator expressivo quanto ao tempo, pois a mesma na maioria dos casos foi degradada nos 5 primeiros minutos e após esse tempo se mantinha sem muitas alterações, sendo mais vulnerável as condições de pH 3,32 e 11,68, altas temperaturas (83,6 °C) e máxima dosagem H2O2 (1000 ppm) aplicados. Além de favorecer a redução da cor ICUMSA da calda, o H2O2 também se mostrou como um bom agente antimicrobiano, principalmente quando associado às altas temperaturas. Agindo com maior intensidade na diminuição da carga bactériana do que na diminuição da carga fungica. A rede neural artificial (RNA) mostrou um bom ajuste e indicou a variável °Brix (teor de sólidos solúveis) como a que apresentou maior influência na redução da cor ICUMSA e a variável tempo a que menor influenciou na redução de cor. / Nowadays, the sugar-energy industry is becoming increasingly competitive, which indeed is encouraged mainly by representative demand and requirements of foreign markets. When analyzing the production of refined sugar can be found barriers to their widespread international acceptance due to the clarification method employed, since this is performed by burning elemental sulfur in combustion boilers. The use of sulfite above the permitted limits can result in potential public health problems. In this regard, Brazil has conducted studies on the adoption of new technologies to replace the sulfite, without changing the quality of the produced refined sugar. On that basis, it was done the evaluation of the use of hydrogen peroxide (H2O2) in commercial solution (35% v/v) as an alternative reagent to sulfur dioxide to obtain refined sugar with less ICUMSA color. For this the sugar liquor VHP different doses of hydrogen peroxide were tested, together with different pH and temperatures outside a central composite design, enabling optimization and monitoring of changes resulting from the process. Thus there was obtained as the best pH conditions 7.5 to 10, temperatures between 50 and 70 °C and dosages between 500 and 797.6 ppm H2O2. The analysis from the chemical kinetics of the peroxidation of the liquor has observed greater reductions in ICUMSA color in general in the time of 50 minutes to 75 minutes and in the first 25 minutes to the extremes of pH, temperature and H2O2 dose. As for sucrose degradation was not a significant factor, since it in most cases was first degraded within 5 minutes and after this time remained without many changes, being more vulnerable conditions (3.32 and 11.68), high temperatures (83.6 °C) and H2O2 maximum dosage (1000 ppm) applied. In addition to further reduce color ICUMSA H2O2 Liquor also showed such a good antimicrobial agent, particularly when combined with high temperatures. Acting with more intensity in the decrease of bacteria than the reduction of fungi. The artificial neural network (ANN) showed good fit and indicated the variable ° Brix (soluble solids) as the one with the greatest influence in reducing the ICUMSA color and variable time that less influenced the color reduction.