2-Chloroethyl ethyl sulfide (CEES) or half-mustard gas, a sulfur mustard (HD) analog, is a genotoxic agent that causes oxidative stress and induces both apoptotic and necrotic cell death. Sodium pyruvate induced a necrosis-to-apoptosis shift in HaCaT cells exposed to CEES levels ≥ 1.5 mmol/L and lowered markers of DNA damage, oxidative stress, and inflammation. This study provides a rationale for the future development of multicomponent therapies for HD toxicity in the skin. We hypothesize that a combination of pyruvates with scavengers/antioxidants encapsulated in liposomes for optimal local delivery should be therapeutically beneficial against HD-induced skin injury. However, the latter suggestion should be verified in animal models exposed to HD.

L'ypérite est une arme chimique de guerre de la famille des vésicants. Sa facilité de synthèse et l'existence de stocks importants dans le monde en font une menace à la fois pour les populations civiles et les militaires. Cette menace est renforcée par le fait qu'à l'heure actuelle il n'existe pas d'antidote efficace contre ce toxique de guerre. L'alkylation de l'ADN par l'ypérite aboutit à la formation d'adduits. L'objectif de cette thèse a consisté à mettre au point une méthode de détection quantificative de ces adduits par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) et d'appliquer cette méthode à l'étude de leur formation et de leur persistance après une exposition cutanée chez la souris SKH-1. Les résultats ont montré dans la peau exposée que la fréquence des adduits était maximale dès 6h post-exposition. Toutefois, leur persistance était relativement longue puisqu'ils étaient toujours détectables 3 semaines après exposition. Une diffusion radiale de l'ypérite a été mise en évidence par la détection des adduits qu'elle forme dans des échantillons de peau non directement exposés. Les adduits ont été également détectés dans plusieurs organes internes. La fréquence maximale des adduits a été mesurée 6h ou J1 post-exposition. Ils ont été décelés jusque J21 post-exposition. Les résultats ont montré qu'il se formait plus d'adduits dans le cerveau et les poumons que dans les reins, la rate et le foie. La persistance des adduits dans le cerveau et les poumons était moindre après la détersion de la peau exposée, illustrant ainsi la constitution dans cette dernière d'un réservoir d'ypérite. La mesure des activités de réparation de l'ADN a montré que l'ypérite exerçait une double action génotoxique, à savoir formation de dommages à l'ADN et inhibition des activités de réparation. / Sulphur mustard is a chemical warfare which belongs to the vesicants family. Its easy synthesis and the existence of important stocks in the world make it a threat for both the general population and militaries. This threat is reinforced by the fact that currently there is not efficient antidote against this war toxic. DNA alkylation by sulphur mustard leads to adducts formation. The objective of this thesis consisted in developing a method of quantification of these adducts by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and to apply this method to the study of the formation and persistence of the adducts after cutaneous exposure in SKH-1 mouse. Results have shown in exposed skin that adducts frequency was maximal as soon as 6h post-exposure. A radial diffusion of sulphur mustard was highlighted by the detection of adducts it forms in skin samples non-directly exposed. Adducts were also detected in several internal organs. Maximal frequency was measured at 6h or d1 post-exposure. They were detected until d21 post-exposure. Results have shown that adducts were produced in larger amount in brain and lungs than in kidneys, spleen and liver. The persistence of adducts was lower in brain and lungs after the detersion of exposed skin, thus illustrating the constitution of a reservoir of sulphur mustard in this tissue. Measurement of DNA repair activities showed that suilphur mustard behave as a two-edge sword genotoxic, namely formation of DNA damages and inhibition of repair activities.

Schwefellost (SM) ist ein verbotener chemischer Kampfstoff. Nach Aufnahme über die Haut führt SM zu einer Reihe von Symptomen. Auf der molekularen Ebene beruht die Toxizität von SM auf der Reaktion mit DNA und Proteinen. Diese kovalenten Addukte eignen sich zum forensischen Nachweis und können über Flüssigkeitschromatographie gekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS) detektiert werden. Ein Hauptziel war es in vitro zu untersuchen ob chemisches Scavenging von N-Acetylcystein (NAC) und Glutathion (GSH) Einfluss in der Behandlung von SM-Vergiftungen hat. Es konnte geklärt werden, dass NAC und GSH a) die Alkylierung von Cys34 in humanen Serum Albumin (HSA) durch SM nicht unterbinden kann und b) den Abbau von SM in gepufferter Lösung nicht beschleunigt. Somit ist Scavenging von SM durch NAC und GSH vernachlässigbar. Trotzdem konnte die Stabilität und die Zuverlässigkeit des Testsystems gezeigt werden. Das zweite Hauptziel war es neue peptidische Biomarker für den Nachweis von SM-Vergiftungen zu finden. Es wurde eine Methode entwickelt, um SM-alkylierte Aminosäurereste in HSA zu finden. Somit konnten 42 SM-alkylierte Peptide gefunden werden. Insgesamt wurden 27 Alkylierungsstellen identifiziert, von denen 24 noch nicht in der Literatur beschrieben wurden. Die vielversprechendste der neue Alkylierungsstellen war das Met329 in HSA. Durch Proteolyse mittels Pepsin wurde das LGM(-HETE)F Tetrapeptid freigeschnitten. Probenvorbereitung und LC-MS Bedingungen wurden optimiert. Allerdings gelang der Nachweis von LGM(-HETE)F in Patientenplasma nicht, was möglicherweise an einer geringeren Stabilität der SM-Alkylierung von Met329 lag. Trotzdem kann sich LGM(-HETE)F als Kurzzeitmarker eignen. Der beobachtete Transfer der HETE-Modifikation vom Met329 zu Glu und Cys Seitenketten stellt einen neuen Einblick in den molekularen Wirkmechanismus von SM dar. Basierend auf diesen Erkenntnissen konnte in Nachfolgestudien die Hemmung von Enzymen durch Alkylierung von Met durch SM gezeigt werden. / Sulfur mustard (SM) is a banned chemical warfare agent. After incorporation, SM may cause tremendous symptoms. On the molecular level, SM reacts with DNA and proteins. These covalent adducts may be useful for forensic or analytical purposes. After adducting SM, proteins can be proteolyzed forming peptides with a SM-modified amino acid residue. These peptide biomarkers can be detected using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). One major aim was to develop an in vitro assay to clarify the impact of chemical scavenging of N-acetylcysteine (NAC) and glutathione (GSH) in the treatment of SM. It was found that NAC and GSH had no relevant influence on a) the extent of alkylation of Cys34 in human serum albumin (HSA) and b) the degradation velocity of SM in buffered solution. Accordingly, it was concluded that chemical scavenging of SM by NAC or GSH is negligible. Nevertheless, the robustness and reliability of the developed in vitro assay was shown. The second major aim was to identify novel peptide biomarkers of SM poisoning. An untargeted method to identify SM-alkylated amino acid residues in HSA was developed. Application of this method revealed 42 SM-modified peptides alkylated at 27 different positions. 24 of these positions were not described in the literature so far. A highly interesting target, Met329 in HSA, was investigated in more detail. After pepsin mediated proteolysis, the covalently modified tetrapeptide LGM( HETE)F was generated. Sample preparation and LC-MS conditions were optimized. However, when applying this novel marker to real samples, it could not be detected likely due to its limited stability. Nevertheless, LGM( HETE)F still represents a suitable short term biomarker. The observed transfer of the HETE-moiety from Met329 to Glu and Cys side chains represents a novel insight into the molecular toxicology of SM. Based on these results follow-up studies proved the enzyme inhibitory effect of SM-alkylation of Met residues in keratin kinase.