Sus1 is a conserved protein involved in chromatin remodeling and mRNA biogenesis. The SUS1 gene of Saccharomyces cerevisiae is unusual, as it contains two introns and is alternatively spliced, retaining one or both introns in response to changes in environmental conditions. SUS1 splicing may allow the cell to control Sus1 expression, but the mechanisms that regulate this process remain unknown. In this thesis project, we have investigated whether the structure adopted by SUS1 RNA sequences contributes to regulate the splicing of this gene. Using in silico analyses together with NMR spectroscopy, gel electrophoresis and UV thermal denaturation experiments, we first show that the downstream intron (I2) of SUS1 forms a weakly-stable, 37-nucleotide stem-loop structure containing the branch site near its apical loop and the 3' splice site after the stem terminus. A cellular assay revealed that two of four mutants containing altered I2 structures had significantly impaired SUS1 expression. Semi-quantitative RT-PCR experiments indicated that all mutants accumulated unspliced SUS1 pre-mRNA and/or induced distorted levels of fully spliced mRNA relative to wild-type. Concomitantly, Sus1 cellular functions in histone H2B deubiquitination and mRNA export were affected in I2 hairpin mutants that inhibited splicing. The second part of the thesis project focuses on the exon located between the two introns of the SUS1 gene. This middle exon (E2) can be skipped during splicing, is generated in circular form, and has been found to influence the splicing of the flanking introns, an unusual situation in budding yeast where splicing mainly relies on intron recognition. Using NMR spectroscopy, gel electrophoresis, UV thermal denaturation and ribose 2'-OH modification experiments combined with computational predictions, we show that E2 of SUS1 comprises a conserved double-helical stem topped by a three-way junction. One of the hairpins emerging from the junction exhibited significant thermal stability and was closed by an unusually structured purine-rich loop. This loop contained two consecutive sheared G:A base pairs and was structurally related to the substrate loop of the VS ribozyme. Cellular assays revealed that three mutants containing altered E2 structures had impaired SUS1 expression and that a compensatory mutation restoring the conserved stem recovered expression to wild-type levels. Semi-quantitative RT-PCR experiments indicated that all mutants were capable of altering the quantities of unspliced and/or fully-spliced SUS1 RNA transcripts relative to wildtype. Overall, the results gathered in this thesis project indicate that RNA structures formed by the middle exon and the second intron of the S. cerevisiae SUS1 gene are relevant for splicing and also influence other processes of SUS1 mRNA biogenesis. / Sus1 es una proteína conservada implicada en remodelación de cromatina y biogénesis de moléculas de ARNm. El gen SUS1 de Saccharomyces cerevisiae es peculiar, ya que contiene dos intrones y sufre un proceso de ayuste (corte y empalme) alternativo, reteniendo uno o ambos intrones en respuesta a cambios en las condiciones ambientales. El ayuste del ARNpre-m de SUS1 puede permitir a la célula controlar la expresión de la proteína Sus1, pero los mecanismos que regulan este proceso son poco conocidos. En este proyecto de tesis hemos investigado si la estructura adoptada por secuencias de ARN de SUS1 contribuye a regular el proceso de ayuste de este gen. Utilizando análisis in silico junto con espectroscopia de RMN, electroforesis en gel y experimentos de desnaturalización térmica monitorizados por UV, primero demostramos que el ARN del segundo intrón (I2) del gen SUS1 forma una horquilla débilmente estable de 37 nucleótidos. Esta horquilla contiene nucleótidos del sitio de ramificación (branch site) en su bucle apical y nucleótidos del sitio 3' de empalme adyacentes al extremo inferior del tallo. A través de ensayos funcionales descubrimos que dos de cuatro mutantes que alteran la estructura de la horquilla I2 exhibían peor expresión de SUS1. Experimentos de RT-PCR semicuantitativos indicaron que todos los mutantes acumularon ARNpre-m SUS1 no ayustado y/o indujeron cambios en los niveles de ARNm maduro con respecto a la secuencia silvestre. Además, las funciones celulares de Sus1 relativas a desubicuitinación de histona H2B y transporte de ARNm se vieron afectadas en los mutantes de la horquilla I2 que inhibían el proceso de ayuste. La segunda parte de la memoria de tesis se centra en el análisis del exón central (E2) situado entre los dos intrones del gen SUS1. Este exón puede eliminarse durante el proceso de ayuste, se genera en forma circular, e influye en el procesamiento de los intrones adyacentes, una situación inusual para las regiones exónicas de S. cerevisiae, donde el ayuste se basa principalmente en el reconocimiento de intrones. Utilizando experimentos de espectroscopía de RMN, electroforesis en gel, desnaturalización térmica y modificación química combinados con predicciones computacionales, demostramos que el ARN del exón E2 de SUS1 forma un tallo conservado de doble hélice coronado por una intersección de tres hélices. Una de las horquillas que emergen de esta intersección presentó una estabilidad térmica significativa, así como un bucle apical rico en purinas inusualmente estructurado. Este bucle contiene dos pares de bases G:A consecutivos y está estructuralmente relacionado con el bucle de substrato de la ribozima VS. Ensayos celulares revelaron que tres mutantes con estructuras modificadas de E2 exhibían peor expresión de SUS1, y que una mutación compensatoria que restauraba el tallo conservado recuperaba la expresión a los niveles de la secuencia silvestre. Experimentos de RT-PCR semicuantitativos indicaron que todos los mutantes de E2 eran capaces de alterar las cantidades de transcritos ayustados y no ayustados de SUS1 con respecto a la secuencia silvestre. En general, los resultados obtenidos en este proyecto de tesis indican que las estructuras de ARN formadas por el exón central y el segundo intrón del gen SUS1 de S. cerevisiae son relevantes para el ayuste y otros procesos implicados en la biogénesis del ARNm del gen SUS1. / Sus1 és una proteïna conservada implicada a la remodelació de la cromatina i la biogènesi de l'ARNm. El gen SUS1 de Saccharomyces cerevisiae és inusual, ja que conté dos introns i s'empalma de manera alternativa, retenint un o ambdós introns en resposta a canvis en les condicions ambientals. L'empalmament de SUS1 pot permetre a la cèl·lula controlar l'expressió de Sus1, però els mecanismes que regulen aquest procés són segueixen sent desconeguts. En aquest projecte de tesi investiguem si l'estructura adoptada per seqüències d'ARN de SUS1 contribueix a regular l'empalmament d'aquest gen. Emprant anàlisi in silico juntament amb espectrometria de RMN, electroforesi en gel i experiments de desnaturalització tèrmica d'UV, es mostra primer que l'intró aigües a baix (I2) de SUS1 forma una estructura de forqueta de 37 nucleòtids feblement estable que conté el lloc de la branca a prop del seu bucle apical; i el lloc d'empalmamnet 3¿ després de l'extrem de la forqueta. Un assaig cel·lular va revelar que dos de quatre mutants que contenien estructures alterades de l'I2 havien modificat significativament l'expressió de SUS1. Els experiments semi-quantitatius de RT-PCR van indicar que tots els mutants acumulaven el pre-ARNm madur respecte al tipus salvatge. Concomitantment, les funcions cel·lulars de Sus1 a la desubiqüitinació de la histona H2B i l'exportació d'ARNm es van veure afectats als mutants de la forqueta d'I2 que inhibeixen l'empalmament. La segona part del projecte de tesi se centra a l'exó situat entre els dos introns del gen SUS1. Aquest exó (E2) es pot ometre durant l'empalmament, es genera amb forma circular, i s'ha trobat que influeix a l'empalmamet dels introns que flanquegen, una situació inusual al llevat on l'empalmament està basat principalment al reconeixement d'introns. Emprant espectroscòpia de RMN, electroforesi en gel, desnaturalització tèrmica d'UV i experiments de modificació de ribosa 2¿-OH combinats amb prediccions computacionals, mostrem que E2 de SUS1 comprén un tall conservat de doble hèlix corornat per una unió de tres vies. Una de les forquetes que emergeixen de la unió, va mostrar una estabilitat tèrmica significativa i va ser tapada per un bucle ric en purina inusualment estructurat. Aquest bucle contenia dos pars de bases G:A tallats consecutivament i estava estructuralment relacionat amb el bucle de substrat del ribozim VS. Els assajos cel·lulars van revelar que tres mutants que contenien estructures alterades de E2 havien alterat l'expressió de SUS1 i que una mutació compensatòria que restaurava el tall conservat recuperava l'expressió a nivells del tipus salvatge. Els assajos cel·lulars van revelat que tres mutants que contenien estructures alterades d'E2 havien alterat l'expressió de SUS1 i que una mutació compensatòria que restaurava el tall conservat recuperava l'expressió a nivell d'un tipus salvatge. Els experiments semi-quantitatius de RT-PCR van indicar que tots els mutants eren capaços d'alterar les quantitats de transcrits d'ARN de SUS1 no empalmats i/o empalmats en relació amb el tipus salvatge. En general, els resultats obtinguts en aquesta investigació indiquen que les estructures d'ARN formades per l'exó mitjà i el segon intró de SUS1 de S. cerevisiae són rellevants per l'empalmament i també influeixen a altres processos de biogènesi de l'ARN de SUS1 / Abuqattam, AN. (2017). IDENTIFICATION OF RNA STRUCTURES MODULATING THE EXPRESSION OF THE mRNA BIOGENESIS FACTOR SUS1 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90524 / TESIS

[EN] One of the defining features of a eukaryotic cell is the presence of a nuclear envelope. This allowed the physical separation between nucleus and cytoplasm, although the presence of a variable number of openings called nuclear pore complexes (NPCs) allowed a constant flow of molecules and information between the two compartments. Certain molecules passively diffuse, but others need energy and specific interactions with transporters and components of the NPC to travel between through both compartments. The messenger RNAs (mRNAs) are among the molecules selectively exported from the nucleus to the cytoplasm. The physical separation between nucleus and cytoplasm isolates the processes of transcription and translation in eukaryotic cells, allowing the cell to select core transcripts competent for export and that will lead to a functional protein in the cytoplasm. The right transcript levels in a cell, depending on the nutritional requirements, reproductive or relationship with the environment is essential for life. To this end, mechanisms regulating transcription, processing, stability, degradation, export or translation of the transcripts, are physically and spatially highly coupled in order to finely regulate the transcript levels in the cell. In Saccharomyces cerevisiae, SUS1 codes for a small protein of 11 kDa highly conserved in all eukaryotes. SUS1 is part of the SAGA transcriptional co-activator, being a submodule component involved in chromatin remodeling. In addition, SUS1 is one of the components of the TREX2 complex, wich interacts with the nuclear pore in the periphery of the nucleus and it is involved in the export of messenger RNAs. The presence of SUS1 in both complexes allows the physical and spatial coupling phenomena of transcription and export of mRNAs. In addition, SUS1 has two introns which is an unusual fact for the S. cerevisiae genome. Unlike other fungi or metazoans, the percentage of genes with introns in S. cerevisiae is very low (5%) and only 10 genes have more than one intron interrupting its coding sequence. The unusual characteristics of SUS1, the role of Sus1 coordinating processes during mRNA biogenesis and its functional conservation in higher eukaryotes, led the research conducted in this dissertation. In this work we studied in detail the biogenesis of SUS1 transcripts. We have identified different factors, acting in cis and trans that are involved in regulating the expression of SUS1 and function of the protein it encodes. On the other hand, we have studied the genetic relationship of SUS1 with components of the 5 '- 3' cytoplasmic degradation machinery and expanded the knowledge about the role of SUS1 during the biogenesis of mRNAs, not only in the nucleus but also in the cytoplasm. / [ES] Una de las características que definen a una célula eucariota es la presencia de una envoltura nuclear. Aunque este hecho permite la separación física entre núcleo y citoplasma, la presencia de un número variable de aberturas, denominadas complejos del poro nuclear (NPCs), permiten un flujo constante de moléculas e información entre ambos compartimentos. Ciertas moléculas difunden de forma pasiva, pero otras necesitan energía e interacciones específicas a través de transportadores y componentes del NPC para transitar entre ambos compartimentos. Entre las moléculas selectivamente exportadas del núcleo al citoplasma se encuentran los RNAs mensajeros (mRNAs). La separación física del núcleo y del citoplasma en eucariotas, aísla los procesos de transcripción y traducción, permitiendo a la célula seleccionar en el núcleo los transcritos competentes para ser exportados y que darán lugar a una proteína funcional en el citoplasma. Adecuar los niveles de transcritos en una célula, en función de las necesidades nutritivas, reproductivas o de relación con el entorno, es esencial para la vida. Para ello, los mecanismos encargados de regular la transcripción, el procesamiento, la estabilidad, la degradación, el exporte o la traducción de los transcritos, se encuentran altamente acoplados física y espacialmente con el fin de regular finamente los niveles de mensajeros en la célula. En el núcleo de las células de la levadura Saccharomyces cerevisiae se encuentra Sus1, una proteína de 11 kDa altamente conservada en eucariotas. Sus1 forma parte del co-activador transcripcional SAGA, siendo componente de un submódulo implicado en la desubicuitinación de la histona H2B. Además, Sus1 es uno de los componentes del complejo TREX2, que interacciona con el poro nuclear en la periferia del nucleo y está implicado en el exporte de RNAs mensajeros y en estabilidad genómica. La presencia de Sus1 en ambos complejos permite el acoplamiento físico y espacial de los fenómenos de transcripción y exporte de mRNAs. Además, el gen SUS1 posee dos intrones, siendo este un evento muy inusual en el genoma de S. cerevisiae. A diferencia de otros hongos o metazoos, el porcentaje de genes con intrones en S. cerevisiae es muy reducido (5%) y solo 10 genes poseen más de un intrón interrumpiendo su secuencia codificante. Las características peculiares del gen SUS1, el papel de la proteína que codifica coordinando procesos durante la biogénesis del mRNA y su conservación funcional en eucariotas superiores, motivó las investigaciones llevadas a cabo en esta tesis doctoral. En este trabajo hemos estudiado en detalle la biogénesis de los transcritos de SUS1. Se han identificado diferentes factores, tanto en cis como en trans, implicados en la regulación de la expresión de SUS1 y en la función de la proteína que codifica. Por otro lado, hemos estudiado la relación genética de SUS1 con componentes de la maquinaria de degradación citoplasmática 5'-3' y hemos ampliado los conocimientos respecto al papel de Sus1 durante la biogénesis de los mRNAs, no solo en el núcleo sino también en el citoplasma. / [CAT] Una de les característiques que definixen a una cèl·lula eucariota és la presència d'un embolcall nuclear. Este fet permet la separació física entre nucli i citoplasma, encara que la presència d'un nombre variable d'obertures, denominades complexos del porus nuclear (NPCs), permet un flux constant de molècules i informació entre ambdós compartiments. Certes molècules difonen de forma passiva, però altres necessiten energia i interaccions específiques amb transportadors i components del NPC per a transitar entre ambdós compartiments. Entre les molècules selectivament exportades del nucli al citoplasma es troben els RNAs missatgers (mRNAs). La separació física del nucli i del citoplasma aïlla els processos de transcripció i traducció en eucariòtes, permetent a la cèl·lula seleccionar en el nucli els transcrits competents per a ser exportats i que donaran lloc a una proteïna funcional en el citoplasma. Adequar els nivells de transcrits en una cèl·lula, en funció de les necessitats nutritives, reproductives o de relació amb l'entorn, és essencial per a la vida. Per a això, els mecanismes encarregats de regular la transcripció, el processament, l'estabilitat, la degradació, l'exportació o la traducció dels transcrits, es troben altament acoblats física i espacialment amb el fi de regular finament els nivells de missatgers en la cèl·lula. En el nucli de les cèl·lules del rent Saccharomyces cerevisiae es troba Sus1, una xicoteta proteïna d'11 kDa altament conservada en eucariotes. Sus1 forma part del coactivador transcripcional SAGA, sent component d'un submòdul implicat en la modificació de histones. A més, Sus1 és un dels components del complex TREX2, que interacciona amb l'embolall nuclear a la perriferia del nucli i està implicat en l'export de RNAs missatgers. La presència de Sus1 en ambdós complexos permet l'adaptament físic i espacial dels fenòmens de transcripció i exportació de mRNAs. A més, el gen SUS1 posseïx dos introns i este fet és inusual en el genoma de S. cerevisiae. A diferència d'altres fongs o metazous, el percentatge de gens amb introns en S. cerevisiae és molt reduït (5%) i només 10 gens posseïxen més d'un intró interrompent la seua seqüència codificant. Les característiques peculiars del gen SUS1, el paper de la proteïna que codifica coordinant processos durant la biogènesi del mRNA i la seua conservació funcional en eucariotes superiors, va motivar les investigacions dutes a terme en esta tesi doctoral. En este treball hem estudiat en detall la biogènesi dels transcrits de SUS1. S'han identificat diferents factors, tant en cis com en trans, implicats en la regulació de l'expressió de SUS1 i en la funció de la proteïna que codifica. D'altra banda, hem estudiat la relació genètica de SUS1 amb components de la maquinària de degradació citoplasmática 5'-3' i hem ampliat els coneixements respecte al paper de Sus1 durant la biogènesi dels mRNAs, no sols en el nucli sinó també al citoplasma. / Cuenca Bono, B. (2016). Identificación y caracterización de elementos reguladores de la expresión de SUS1 y nuevas funciones celulares para la proteina Sus1 en Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62327 / TESIS