La signalisation cellulaire est un processus fondamental par lequel les organismes multicellulaires assurent un développement normal et maintiennent leur homéostasie. La communication entre les divers organites joue un rôle crucial en ce sens. Les sites de contact membranaires (SCM), régions de proche apposition entre deux organites (environ 20 nm), sont importants dans le maintien de la communication inter-organite. Une étude minutieuse de cette communication est indispensable pour comprendre certains fascinants mystères de la nature. Récemment, les protéines apparentées aux synaptotagmines (ESyt) ont été identifiées comme étant des protéines résidentes au niveau du Réticulum Endoplasmique (RE) et impliquées dans le maintien des sites de contact entre le RE et la Membrane Plasmique (RE-PM). Trois protéines appartiennent à cette famille, dénommées ESyt1-3. Celles-ci sont également impliquées dans la reconnaissance des récepteurs conduisant à l’endocytose du récepteur et la signalisation en aval. Dans ce manuscrit, nous présentons l’interaction des ESyt avec FGFR1-4, EGFR ainsi que le récepteur MET et proposons que les ESyt interagissent avec de nombreux récepteurs tyrosine-kinases (RTK). Nous avons montré que les membres de la famille ESyt (ESyt1, ESyt2a et ESyt2b (variant d’épissage) et ESyt3) sont capables d'homo- et hétéro-dimérisé via leurs séquences proximales à, ou chevauchantes leur domaine transmembranaire (TM) (a.a. 88 à 138). De plus, il a été montré que l'interaction de ESyt2 avec FGFR1 est dépendante de l'état actif du récepteur. Cependant, l'autophosphorylation du récepteur ou son activation catalytique per se ne sont pas requises. Le site de liaison à ESyt2 sur FGFR1 est proche du site de liaison à l'ATP au sein du lobe supérieur du domaine catalytique du récepteur. Il devient accessible lorsque la boucle d'activation est déplacée dans sa conformation active. Le site d'interaction sur ESyt2 se situe dans la même région que la séquence nécessaire à la dimérisation de ESyt (a.a 88 à 138) et ne requière pas le domaine SMP adjacent. Finalement, nous montrons que la perte de ESyt2 et Esyt3 n’affecte ni le développement ni la viabilité chez la souris, malgré que la migration cellulaire et la survie sont affectées suite à des stress in vitro. / Cellular signaling is one of the fundamental process by which multicellular organisms maintain their normal development and homeostasis. Inter-organelle communication plays a crucial role in governing such processes. Membrane contact sites (MCS), a region where two organelles come in close proximity (within ≈20nm), helps in maintaining the inter-organelle communication. A thorough study of inter-organelle communication is required to understand some of the wonderful mysteries of nature. Recently Extended Synaptotagmin-like proteins (ESyts) have been found to be Endoplasmic Reticulum (ER) resident proteins that have been attributed the function of maintaining the ER-Plasma Membrane (ER-PM) contact sites. Three proteins belong to this family, namely ESyt1 to 3. Further, ESyts have been implicated in receptor recognition, receptor endocytosis and downstream signaling. Here I present the interaction of ESyts with FGFR1-4, EGFR and the MET receptor and propose that ESyts interact with a broad range of receptor tyrosine kinases (RTKs). The members of ESyt family (ESyt1, ESyt2a and ESyt2b (spliced variants), and ESyt3) are shown to homo- and heterodimerize via sequences proximal or overlapping their transmembrane domains (TM) (a.a. 88 to 138). It is shown that the interaction of ESyt2 with FGFR1 is dependent on the active state of the receptor. In contrast, neither receptor autophosphorylation nor catalytic activation per se is required. Rather, the interaction depends upon the active conformation of the receptor catalytic domain. The ESyt2 binding site on FGFR1 lies close to its ATP binding fold within the upper lobe of the receptor catalytic domain and is revealed when the receptor activation loop is displaced into the active conformation. The interaction site on ESyt2 lies within the same sequences that are required for ESyt dimerization (a.a. 88 to 138) and does not require the adjacent SMP homology domain. Finally, it is shown that the loss of ESyt2 and ESyt3 does not affect mouse development or viability. However, in vitro cell migration and survival under stress are affected.

Les voies de signalisation Wnt et FGF sont parmi les plus importantes dans les communications inter-cellulaires qui régissent le développement et l’homéostase des tissus embryonnaires ou adultes. Bien que l’on connaisse énormément de choses sur ces voies et les protéines qui les composent, plusieurs questions persistent quant à leur régulation. Notre travail fait usage du modèle amphibien Xenopus laevis dans l’étude du rôle de deux MAP4K kinases de la famille Misshapen: xTNIK et xMINK dans la balance entre les branches «canonique» et «non-canonique» de la signalisation Wnt, ainsi que dans l’étude d’une nouvelle protéine adaptatrice de l’endocytose: E-Syt2 et de son rôle dans la régulation de la signalisation FGF. La voie signalétique Wnt est principalement traduite par la famille des récepteurs serpentins Frizzled vers deux voies distinctes : la voie dite «canonique» régulant la β-catenine nucléaire, et la voie dite «non-canonique» qui active les petites GTPases Rac et RhoA ainsi que la MAP-kinase JNK et les PKCs. Nous montrons ici que TNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) et xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) sont des composantes essentielles de ces deux voies de réponse. xTNIK et xMINK interagissent ensemble in vivo et subissent un clivage protéolytique libérant des domaines Kinase et Citron-NIK-Homology (CNH) respectivement activateur et suppresseur du signal. Les deux kinases interviennent dans la voie «non-canonique» cependant, alors que xTNIK est également un médiateur de la voie «canonique», xMINK y joue un rôle antagoniste et ces effets dépendent de leurs activités catalytiques. Nous apportons enfin la preuve qu’une régulation spécifique du clivage protéolytique des deux pro-enzymes dans les différents tissus embryonnaires régule leur activité de façon différentielle et suggérons qu’il s’agit là d’un mode d’aiguillage de la réponse Wnt entre les voies «canonique» et «non-canonique» in vivo. Enfin, nous montrons que la protéine membranaire de type synaptotagmine E-Syt2 est essentielle dans la phase précoce de l’endocytose du récepteur aux FGF activé, elle-même nécessaire à l’activation de ERK et à l’induction du mésoderme. E-Syt2 interagit spécifiquement avec le récepteur aux FGF activé ainsi qu’avec l’Adaptin-2. Il est en outre requis en amont de Ras dans l’activation de ERK et nos données identifient donc E-Syt2 comme un adaptateur endocytique de la voie de la clathrine. / The Wnt and FGF pathways are among the most critical inter-cellular signalling pathways controlling embryo development and the homeostasis of adult tissues. Although much is known about the signal transduction routes and proteins constituting these pathways, many questions concerning their regulation remain to be answered. The present work uses the Xenopus laevis model system to study the role of two kinases of the Misshapen family of MAP4K signalling kinases, xTNIK and xMINK, in the balance between canonical and non-canonical branches of Wnt signalling, and the role of a new endocytic adapter protein, E-Syt2, in regulation of FGF signalling by endocytosis. Wnt signals are predominantly transduced via the Frizzled family of serpentine receptors to two distinct pathways, the canonical pathway regulating nuclear -catenin and a non-canonical pathway that activates the small GTPases Rac and RhoA, the JNK MAP-kinase and PKC. My work shows that xTNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) and xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) are essential and indeed integral components of both the canonical and non-canonical Wnt pathways. xTNIK and xMINK interact with each other and are proteolytically cleaved in vivo to generate Kinase domain fragments that are active in signal transduction, and Citron-NIK-Homology domain (CNH) fragments that are suppressive. The Kinase domain fragments of xTNIK mediate both canonical and non-canonical signalling, whereas those derived from xMINK mediate non-canonical signalling but strongly antagonize canonical signalling. This work suggests that tissue specific regulation of the proteolytic cleavage of xTNIK and xMINK controls the balance between canonical and non-canonical Wnt signalling. The synaptotagmin-related membrane protein E-Syt2 was found to be essential for an early phase of activated FGF receptor endocytosis that is necessary for functional ERK activation and mesoderm induction. E-Syt2 interacts selectively with the activated FGF receptor and with Adaptin-2, and is required upstream of Ras for ERK activation. Together these data identified E-Syt2 as an endocytic adapter for the Clathrin-dependent pathway.

Les neurones dopaminergiques (DA) du mésencéphale jouent un rôle clé dans le contrôle moteur, les comportements motivés et la cognition. Les neurones dopaminergiques peuvent libérer la DA non seulement à partir de leurs terminaisons axonales, mais également à partir de leur compartiment somatodendritique (STD). Une partie de cette libération dépend de l’activité électrique des neurones (libération phasique de DA), de l’influx de calcium et de l’activation de senseurs calciques, tandis que d’autres formes de libération impliquent l’activation locale d’afférences synaptiques en provenance d’autres neurones ou survient de manière spontanée. Les mécanismes et rôles physiologiques de ces différentes formes de libération sont encore méconnus. Dans cette thèse, je me suis intéressé spécifiquement à la libération phasique de dopamine et au rôle joué par les senseurs calciques régulateurs de l’exocytose de la famille des synaptotagmines (Syts). En utilisant des modèles in vivo de souris knock-out de certaines isoformes de cette famille, j’ai ainsi démontré que Syt1 est la principale isoforme impliquée dans la libération phasique de dopamine au niveau des terminaisons axonales, tandis que les isoformes Syt4 et Syt7 jouent un rôle plus spécifique dans la libération au niveau du soma et des dendrites. La souris Syt1 cKODA a par ailleurs révélé l’exceptionnelle résilience de certaines fonctions dopamino-dépendantes, notamment dans le contrôle de la locomotion spontanée et induites par des drogues, qui sont surprenamment conservées dans un contexte de quasi-abolition de la libération phasique de DA. Des adaptations importantes du système DA ont été observées chez les souris Syt1 cKO et sont comparables à celles observées dans les stages précoces de la maladie de Parkinson. Ces travaux apportent ainsi un nouvel éclairage sur pourquoi une perte drastique de l’innervation dopaminergique est requise pour aboutir aux symptômes moteurs typiques de cette maladie. Ils apportent également de nouvelles perspectives et modèles à l’étude des mécanismes et fonctions de la libération tonique (spontanée) de DA dans le cerveau. / Dopaminergic (DA) neurons in the midbrain play a key role in motor control, motivated behaviors and cognition. Dopaminergic neurons can release DA not only from axon terminals, but also from their somatodendritic compartment (STD). Part of this release depends on electrical activity (phasic release of DA), calcium influx and activation of calcium sensors, while other forms of release involve local activation of synaptic inputs from other neurons or occurs spontaneously. The mechanisms and physiological roles of these different forms of release are still poorly understood. In this thesis, I focused on the phasic release of DA and the role played by calcium sensors from the synaptotagmin (Syt) family regulating exocytosis. By using in vivo knockout mouse models of isoforms from this family, I demonstrated that Syt1 is the main calcium sensor involved in phasic DA release at axonal endings, while the Syt4 and Syt7 isoforms play a more specific role in the release at the level of the soma and dendrites. Syt1 cKODA model also revealed the exceptional resilience of certain DA-dependent functions such as spontaneous and drug-induced locomotion, which are surprisingly preserved in a context of a near abolition of phasic DA release. Important adaptations in the DA system were observed in Syt1 cKO mice and are comparable to those seen at early stages of Parkinson's disease. This work thus sheds new light on why a drastic loss of dopaminergic innervation is required to lead to the motor symptoms typical of this disease. They also bring new perspectives and models to the study of the mechanisms and functions of tonic (spontaneous) DA release in the brain.