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La méthylation de l’uridine sur son carbone 5 est apparue au cours de l’évolution sous plusieurs formes. Tout d’abord, les thymidylate synthases permettent la synthèse de novo du dTMP, un précurseur essentiel de l’ADN des trois règnes du vivant. Deux familles de thymidylate synthases sont connues à ce jour : ThyA et la flavo-enzyme ThyX, codées par des gènes hétérologues et ayant des structures et mécanismes réactionnels radicalement différents. En outre, cette méthylation de l’uridine est apparue (probablement plus tard) sous forme de modifications post-transcriptionnelles des ARNt et ARNr. Cette thèse vise à questionner les contraintes évolutives ayant menés indépendament à ces quatres types de méthylation de l’uridine.Une première partie décrit l’identification d’une voie métabolique permetant la complémentation du phénotype d’auxotrophie pour la thymidine par des analogues nucléotidiques chez Escherichia coli. Une approche de biologie synthétique en vue d’établir une voie alternative de biosynthèse du thymidylate a aussi été mise en œuvre. Une technique de sélection de gènes de complémentation du phénotype d’auxotrophie pour la thymidine, issus de mutagénèse aléatoire, a pu être développée. Dans une seconde partie, des études biochimiques et sppectroscopiques ont été réalisées sur la méthyle-transférase flavine-dépendante TrmFO, responsable de la méthylation post-transciptionnelle de l’uridine 54 des ARNt de certains microorganismes.L’implication de certains résidus dans la fixation du substrat a pu être déterminée d’une part, et certains intermédiaires réactionnels potentiels ont été caractérisés spectralement d’autre part. Ces dernières observations s’appuient, en outre, sur des études en cours de spectroscopie résolue en temps et des simulations de dynamique moléculaire afin de mieux comprendre les flavoprotéines en général et les méthyle transférases flavine-dépendantes en particulier. / Enzymes catalyzing the methylation of uridine at its carbon 5 position have appeared independently in different forms across evolution. Thymidylate synthases ThyA and the flavoprotein ThyX catalyze the de novo synthesis of dTMP, an essential DNA precursor in the three domains of life. They are encoded by heterologous genes and have drastically different structures and reaction mechanisms. On the other hand, this uridine methylation is also performed by tRNA and rRNA post-transcriptional modification enzymes.This thesis assesses the question of the evolutionary constraints that have led independently to four kinds of uridine methylation. The first part describes the identification of a metabolic pathway allowing the complementation of thymidine auxotrophy by non-natural nucleotide analogs in Escherichia coli. A synthetic biology approach, aiming to establish an alternative pathway for thymidylate biosynthesis, was also implemented and a selection strategy for thymidine auxotrophy-complementing genes, could be developed.In a second part, biochemical and spectral studies where realised on the flavin-dependent methyltransferase TrmFO, responsible for the post-transcriptional methylation of uridine at the invariant position 54 of tRNA in several microorganisms. The involvement of specific amino acid residues in substrate fixation and in stabilization of potential reaction intermediates was demonstrated. Their spectral characterization supports previously proposed reaction schemes for flavin-dependent thymidylate forming enzymes. These observations are currently being pursued by parallel approaches combining time-resolved spectroscopy and molecular dynamics simulations, aiming to further our understanding of how flavin mediates the transfer of carbon molecules from folate to uracil rings.