Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI), also called procarboxypeptidase U (proCPU), is a plasma zymogen that can be activated by thrombin, the thrombin-thrombomodulin complex, or plasmin. The activated form of TAFI (TAFIa, CPU) removes C-terminal lysine residues of plasmin-modified fibrin (FN’) that mediate positive feedback in plasminogen (Pg) activation, thereby attenuating fibrinolysis. The plasma concentration of TAFI is ~75nM. Since the half-maximal effect of TAFIa occurs at 1nM, only about 1.3% of TAFI needs to be activated to exert an effect on clot lysis. The first objective of this work was to design a novel assay that can measure functional TAFIa levels in plasma. We have successfully developed a reliable TAFIa assay that is sensitive to TAFIa concentrations as low as 12pM. This assay is not confounded by endogenous levels of Pg or by a naturally occurring polymorphism at position 325 that affects the half-life of TAFIa. The second objective was to measure TAFI activation in vivo in primates in response to thrombin generation, E. coli-induced sepsis, or post-surgical stress. It was found that chimpanzees generated substantial amounts of TAFIa in a transient manner which had a half-life of ~8 to 10 minutes in response to thrombin generation. Baboons generated very high levels of TAFIa transiently in response to sublethal or lethal doses of E. coli. Interestingly, baboons generated less TAFIa when infused with thrombin followed by the blocking of endothelial protein C receptor (EPCR) than when the baboons were infused with only thrombin. Human patients that underwent hip replacement surgery showed sustained, elevated levels of TAFIa for up to 42 days after surgery. The third objective was to determine the kinetics of TAFIa-catalyzed release of bound plasminogen from soluble fibrin degradation products. The kinetics conformed to the Michaelis-Menten equation, which allowed the determination of Km, kcat and Vmax values for varying concentrations of TAFIa. In addition, the enzymatic activity of TAFIa appeared to saturate, probably because at a high concentration of TAFIa, the kinetics of plasminogen release were rate limiting. / Thesis (Master, Biochemistry) -- Queen's University, 2007-09-27 13:08:29.462

En collaboration avec les Laboratoires Servier, nous présentons la synthèse d'une nouvelle famille d'inhibiteurs portant un groupe thiol ou carboxyle, développé comme antagoniste du TAFIa en vue d'une nouvelle thérapie antithrombotique et thrombolytique. L'étape clé de cette synthèse consiste en la formation de motifs β-lactames gem-difluorés. Dans ce but, la synthèse chimio- et stéréosélective de β-aminoesters et de β-lactames gem-difluorés à partir du bromodifluoroacétate d'éthyle et d'imines par réaction de Reformatsky a été étudiée. L'influence de paramètres réactionnels variés, la nature de l'amine et de l'aldéhyde, la nature de l'auxiliaire chiral ont été évaluées. De hauts degrés de stéréosélectivité (jusqu'à 98%) ont été obtenus pour les gem-difluoro-β-aminoesters et les gem-difluoroazétidin-2-ones en employant soit le (R)-phénylglycinol soit le (R)-méthoxyphénylglycinol. Nous avons également développé une procédure efficace pour effectuer la synthèse de gem-difluoro-β-lactames racémiques. Ces composés ont été obtenus par réaction de Reformatsky entre le bromodifluoroacétate d'éthyle et diverses imines de la p-méthoxybenzylamine. La synthèse de gem-difluoro-β-aminoesters racémiques est accomplie par réaction de Gilman-Speeter entre un sel d'iminium généré selon la procédure de Katritzky et le bromodifluoroacétate d'éthyle. Après une déprotection efficace de ces gem-difluoro-β-aminoesters et gem-difluoro-β-lactames, nous avons étudié la N-alkylation et la N-acylation pour l'introduction du groupe chélateur du zinc, e.g. un groupe portant un acide carboxylique ou un thiol, ainsi qu'un groupe espaceur. Après déprotection, ces composés ont été évalués pour l'inhibition de la carboxypeptidase U par la Division Angiologie de l'IdRS. Malheureusement tous ces dérivés n'ont présenté qu'une IC50 supérieure à 33 rM. Néanmoins, nous avons développé une méthode générale et efficace pour synthétiser des dérivés pseudopeptidiques gem-difluorés comme des building blocks originaux, avec une large gamme d'application.