Bergische Universiẗat, Bachelorarbeit--Wuppertal, 2006.

Aachen, Techn. Hochsch., Thesis (doctoral), 2000.

Thesis (doctoral)--Universität St. Gallen, 2003.

Die Chemotherapie hat in letzten Jahren in der Veterinärmedizin zunehmend an Bedeutung gewonnen. Das Zytostatikum Methotrexat (MTX) wird in der Veterinärmedizin vorwiegend zur Behandlung von Lymphomen und lymphatischen Leukämien eingesetzt. In der Humanmedizin findet es aufgrund seiner immunsuppressiven Wirkung auch bei nicht neoplastischen Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis Anwendung. Die Aufnahme von reduzierten Folaten und MTX wird vornehmlich als aktiver Transport über den Reduced folate carrier (Rfc) vermittelt. Inzwischen konnte die für das Transportprotein codierende cDNA aus Maus (mRfc) und Hamster (haRfc) und Mensch (hRFC) isoliert und das jeweilige Gen identifiziert werden. Ein orthologes Transportsystem für MTX (MTX-Carrier) wurde auch für die Ratte beschrieben. Die full-length cDNAs des MTX-Carriers wurden aus Leber und Niere isoliert und die Proteine funktionell charakterisiert. Während die cDNAs der MTX-Carrier aus Leber und Niere im codierenden Sequenzbereich identisch waren und für ein Protein bestehend aus 512 Aminosäuren codierten, wiesen die cDNAs im 5´-untranslatierten Bereich unterschiedliche Sequenzen auf. Aus der Leber wurde zudem eine cDNA Variante des MTX-Carriers isoliert, die sich im Sequenzvergleich mit der cDNA des MTX-Carriers durch eine Insertion von 203 bp auszeichnete und als MTX-2 bezeichnet wurde. Die Varianz ist möglicherweise auf alternatives Spleißen der Prä-mRNA zurückzuführen. Alternatives Spleißen ist ein wichtiger Mechanismus, verschiedene Proteine aus einem Gen zu generieren. Während in den letzten Jahren zwar zunehmend alternativ gespleißte Transkripte auch für den RFC entdeckt wurden, wurden nur verhältnismäßig wenige dieser Transkripte weiterführend charakterisiert. In dieser Arbeit wurden Splicing-Varianten des MTX-Carrier der Rattenniere molekularbiologisch und zellbiologisch charakterisiert. Für die Niere wurden mittels RT-PCR vier mögliche Splicing-Varianten des MTX-Carriers (RK-MTX-1, RK-MTX-2, RK-MTX-5 und RK-MTX-6) identifiziert. Dabei wies die Variante MTX-2 im Vergleich zum MTX-1 eine Insertion von 203 bp auf und war in der 5´-UTR identisch mit dem renalen MTX-1. Die Varianten MTX-5 und MTX-6 wiesen eine Deletion von 119 bp und 116 bp auf. Ein Vergleich der Sequenzen dieser renalen Varianten und der bekannten Sequenzen der Varianten aus der Leber (RL-MTX-1, RL-MTX-2) mit den Daten des Rat Genome Project führte zur Identifizierung des MTX-Gens auf dem Rattenchromosom 20 (NCBI AABR01066371) sowie zur Aufklärung seiner genomischen Organisation. Insgesamt wurden auf diese Weise 7 Exons und 6 Introns erkannt. Gleichzeitig konnten die Varianten als Splicing-Varianten des MTX-Carriers definiert werden. Die ersten beiden Exons werden alternativ in Leber und Niere genutzt, daher ist anzunehmen, dass der Prozess des alternativen Spleißens der Exons I und Ia gewebsspezifisch erfolgt und wahrscheinlich regulatorisch von Bedeutung ist. Die Insertion von 203 bp des MTX-2 in Leber und Niere erklärt sich durch die Retention des Intron III. Die Varianten MTX-5 und MTX-6 entstehen durch die verkürzten alternativen Exons IIIa und IVa durch die Nutzung alternativer Splice-Sites. Während die unterschiedlichen 5´-UTR des renalen und hepatozelluären MTX-1 keine Auswirkungen auf die Proteinstruktur haben, ergeben sich für die Varianten MTX-2, MTX-5 und MTX-6 laut Proteinvorhersage weitreichende Konsequenzen. Das alternative Spleißen führt in allen Varianten zu einem vorzeitigen Stopp-Codon in der codierenden Region und in der Folge zu C-terminal verkürzten Proteinvarianten. Während für den MTX-1 12 TMD vorausgesagt sind, codieren die cDNAs der Varianten nur noch für ein Protein mit 7 TMD (MTX-2, MTX-6) bzw. 6 TMD (MTX-5). Studien mit Deletionskonstrukten des RFC/Rfc anderer Spezies zeigten, dass in den C-terminalen TMD 7-12 bedeutsame Strukturen funktioneller und struktureller Art lokalisiert sind. Insbesondere fehlen den Varianten damit die Substratbindungsdomäne, sowie noch nicht identifizierte Strukturen oder Sequenzen, die für das Protein-Targeting zur Zellmembran erforderlich sind. Funktionelle Untersuchungen am RK-MTX-2 zu einer Aufnahmeaktivität von MTX in stabil transfizierten MDCK führten zu keinem eindeutigen Ergebnis. Während die mRNA-Expression nachgewiesen werden konnte, wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz und Westernblot keine Proteinexpression des RK-MTX-2 ermittelt. Die Proteinexpression der Splicing-Varianten MTX-1, MTX-2, MTX-5 und MTX-6 konnte jedoch anhand von GFP-Fusionsproteinen in transienter Transfektion in ihrem zeitlichen Verlauf dargestellt und die subzelluläre Lokalisation der Proteine bestimmt werden. Im Ergebnis zeigte sich, dass die Proteine MTX-2, MTX-5 und MTX-6 geringer als MTX-1 und das ungekoppelte GFP exprimiert wurden. Im Gegensatz zum MTX-1 blieb die für ein Transportprotein notwendige Lokalisation in der Zellmembran aus. Stattdessen kam es über einen Zeitraum von 72 h zur Akkumulation in subzellulären Strukturen im Zytoplasma, möglicherweise dem endoplasmatischen Retikulum. Es ist anzunehmen, dass den Varianten aufgrund ihrer verkürzten Proteinstruktur die notwendigen Strukturen für das Protein-Targeting fehlen und sie somit nicht korrekt zur Zellmembran transportiert und folglich abgebaut werden. Nach stabiler Transfektion war im Gegensatz zum GFP und GFP-MTX-1 keine Proteinexpression nachweisbar. Die RNA hingegen wurde bei allen Varianten stabil exprimiert. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass den Varianten als mögliche Proteinisoformen des MTX-Carriers zumindest in vitro keine funktionelle Bedeutung zugesprochen werden kann. Durch die vorzeitigen Stopp-Codons (PTC) in den Varianten, die durch das alternative Spleißen entstehen, sind sie als mögliche Substrate für den „Nonsense Mediated Decay“ (NMD) klassifiziert. Der NMD dient einerseits dem Abbau fehlerhafter und fehlgespleißter mRNA. Möglicherweise sind die Splice-Sites des Intron III nicht eindeutig und stellen einen Schwachpunkt der DNA des MTX-Gens (rat slc19a1) dar. Andererseits könnte die Kopplung vom alternativen Spleißen und NMD auch eine große Bedeutung in der Regulation der Proteinexpression einnehmen. In Bezug auf den MTX-Carrier könnte der MTX-Transport über die Steuerung der Menge der Transkripte der Splicing-Varianten reguliert sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich die Notwendigkeit einer sowohl molekularbiologischen als auch funktionellen Untersuchung möglicher alternativer Splicing-Varianten.

Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 2006

Zugl.: Hamburg, Univ., Diss., 2003/04

Zugl.: Kaiserslautern, Techn. Univ., Diss., 2005

Zugl.: Wuppertal, Univ., Diss., 2005

Zugl.: Potsdam, Univ., Diss.

Hochschule der Medien, Diplomarb.