Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer / From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

A partir de paramètres électriques comme le courant de court-circuit, la tension transépithéliale et la conductance, il est possible d'étudier des phénomènes de transports électrogéniques à travers un tissu biologique. Ces mesures peuvent contribuer à l'étude d'une molécule en fonction de sa traversée et de son action sur les propriétés de l'épithélium, de son mécanisme de transport, de sa relation concentration-passage ou encore de ses effets comparés à des molécules de référence. Le travail réalisé porte sur la conception d'un système automatisé permettant de mesurer ces trois paramètres électriques. Le principe de base utilisé est celui de la chambre d'Ussing. Il consiste à monter un tissu biologique entre deux demi-chambres pour isoler ses cotés muqueux et séreux et à mesurer ses paramètres électriques par l'intermédiaire d'électrodes de courant et de référence. L'étude a abouti à la réalisation d'une chambre d'Ussing modifiée pour optimiser la circulation de la solution physiologique et homogénéiser la densité de courant électrique traversant le tissu biologique. Des électrodes en acier inoxydable ont également été étudiées pour démontrer leur utilisation possible dans la chambre. Le principe de mesure retenu est fondé sur un correcteur défini d'après une fonction de transfert simplifiée du système. Une modélisation plus précise des interfaces et de différents tissus a été réalisée par impédancemétrie et a été utilisée pour la simulation et la calibration du correcteur. Les résultats obtenus ont été confrontés à un système de référence et permettent d'envisager par la méthode proposée une utilisation améliorée des chambres d'Ussing.