Insulin-like 3 (INSL3), une hormone spécifique aux cellules de Leydig (LC), est essentielle à la descente testiculaire pendant la vie foetale tandis que chez l'adulte elle agit comme un facteur de survie des cellules germinales. Malgré ses rôles essentiels pour le développement et la fonction du système reproducteur mâle, peu est connu sur la régulation de l'expression de INSL3 dans les LC. L'objectif principal de ce mémoire est donc d'identifier des facteurs de transcription (TFs) régulant l'expression de INSL3 dans les LC. Afin d'identifier ces TFs, j'ai isolé et procédé à une analyse détaillée d'un fragment de 1.1 kb du promoteur humain INSL3 à l'aide de deletions séquentielles en 5', de mutagenèse dirigée et de transfections, ce qui m'a permis de localiser un élément de 10 pb responsable de 70% de l'activité du promoteur INSL3 dans les LC. Cet élément contient un site consensus de liaison (CACCC) pour les membres de la famille de TFs Kruppel-like factor (KLF). Par la suite, j'ai utilisé une stratégie de PCR dégénérée, RT-PCR et d'immunobuvardage pour évaluer l'expression de KLF dans les LC. Des essais de retardement sur gel (EMSA) ont été effectués pour étudier la liaison des KLF au promoteur hINSL3. Avec la PCR dégénérée, j'ai constaté que les cellules de Leydig MA-10 expriment au moins KLF2, 3, 5, 6 et 13. En utilisant des d'amorces KLF6-spécifiques, nous avons observé que ce dernier est exprimé tout au long du développement testiculaire chez la souris (e14 à l'adulte). L'immunobuvardage a aussi confirmé la présence de la protéine KLF6 dans diverses lignées cellulaires de Leydig. Les essais de retardement sur gel ont montré que KLF6 pouvait se lier à l'élément de 10 pb. Enfin, j'ai constaté que KLF6 active significativement le promoteur humain INSL3 et que cette transactivation nécessite l'élément KLF intact dans le promoteur. En résumé, mes résultats suggèrent un rôle pour KLF6 dans la régulation de l'expression de INSL3 et conséquemment dans le développement et la fonction du système reproducteur mâle.

Insulin-like factor 3 (INSL3) est une hormone qui est exprimée spécifiquement dans les cellules de Leydig chez le mâle et les cellules de la thèque chez la femelle. INSL3 joue un rôle essentiel dans le développement et la fonction de l'appareil reproducteur mâle. En effet, LNSL3 contrôle la 1ère phase de la descente testiculaire pendant la vie foetale et agit comme facteur de survie des cellules germinales chez l'adulte. Malgré son rôle crucial chez le mâle, on sait peu de choses quant à sa régulation transcriptionnelle dans les cellules de Leydig. Jusqu'à présent seulement 2 facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateur de la transcription d'Insl3 : les récepteurs nucléaires SF-1 et NUR77. Toutefois, ces récepteurs sont exprimés dans de nombreux autres tissus qui n'expriment pas Insl3, indiquant que d'autres facteurs de transcription sont requis pour l'expression spécifique d'Insl3 dans les cellules de Leydig. Afin d'identifier ces facteurs de transcription, nous avons isolé et analysé un fragment de 1.1 kb du promoteur souris d'Insl3. Grâce à des deletions 5' progressives, j'ai identifié une région de 27 pb responsable de 70% de l'activité transcriptionnelle d'Insl3.

Plusieurs études ont démontré l’existence d’une corrélation directe entre l’exposition fœtale à des contaminants environnementaux (comme le DEHP ou les estrogènes) et la perturbation de la différenciation sexuelle chez les fœtus mâles. Ces études ont notamment mis en évidence l’existence d’une fenêtre de susceptibilité; une période pendant laquelle l’exposition des cellules de Leydig aux contaminants perturbe leurs activités et entraine une diminution de leurs sécrétions des hormones testostérone (T) et Insulin-like 3 (INSL3). Ces hormones sécrétées par les cellules de Leydig sont requises pour la différenciation sexuelle du fœtus mâle, l’adoption des caractéristiques masculines primaires et secondaires (revue de Robert Courrier, 1962). Ces hormones influencent aussi la formation des spermatozoïdes et le comportement sexuel. Les études démontrent qu’une production insuffisante de ces hormones est corrélée avec une fertilité réduite (de modérée à très grave), une sous-masculinisation, la non-descente des testicules dans le scrotum (cryptorchidie) et parfois même une féminisation des organes sexuels primaires. Selon plusieurs spécialistes, ces symptômes seraient le résultat d’une perturbation de l’ontogenèse des testicules durant le développement fœtal. Syndrome de dysgénésie testiculaire est le nom qui a été donné à cette théorie. La cryptorchidie congénitale découlerait donc d’une insuffisance d’activités hormonales et révélerait par le fait même un problème de dysgénésie testiculaire. Bien que la prévalence varie à travers le monde, il semblerait, qu’en moyenne, au moins 4 % des nouveau-nés naissent avec cette condition. La localisation des testicules cryptorchides peut être corrigée chirurgicalement par orchiopexie (orchidopexie). Néanmoins, la correction chirurgicale ne semble pas être suffisante puisque les individus cryptorchides à la naissance demeurent plus à risque de développer un cancer du testicule et de souffrir de problèmes reliés à la fertilité, et ce, même après correction chirurgicale. Bien que les preuves provenant des études épidémiologiques et animales soient de plus en plus explicites, les preuves moléculaires demeurent partielles ou peu concluantes. Des preuves de nature moléculaire pourraient permettre de mieux définir le risque réel que représente le DEHP pour la santé humaine et la fertilité masculine. Le principal objectif des recherches effectuées était d’identifier et de valider un modèle in vitro permettant l’étude de composés potentiellement toxiques en minimisant le sacrifice d’animaux. À travers ces travaux, nous démontrons que la testostérone (T) augmente les niveaux d’ARNm d’Insl3 dans une lignée de cellules de Leydig et dans des cellules de Leydig primaires. Nous démontrons aussi que la testostérone induit l’activité des promoteurs d’Insl3 de différentes espèces. De plus, nous mettons en évidence que l’effet inducteur de la T sur l’activité transcriptionnelle et l’ARNm d’Insl3 nécessite le récepteur aux androgènes (AR). Nous avons localisé l’élément de réponse à la T sur le promoteur proximal d’INSL3. Cette région est toutefois dépourvue d’un élément de réponse aux androgènes consensus, ce qui suggère un mécanisme d’action indirect. Enfin, nous démontrons que le mono-(2-éthylhexyl) phtalate, le métabolite actif du perturbateur endocrinien DEHP, réprime aussi la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig en antagonisant l’action de la dyade T/AR. Nous démontrons que l’estradiol (E2) réduit le niveau d’ARNm d’Insl3 dans les cellules de Leydig MA-10. Nos résultats démontrent qu’E2 réduit l’activité des promoteurs humain et murin d’Insl3/INSL3. Nous avons circonscrit la région répondant à l’E2 sur le promoteur proximal du promoteur humain d’INSL3. Cette région ne contient pas d’élément consensus de réponse aux estrogènes. Ceci indique que le mécanisme de répression est indirect. Conformément à cela, nous avons noté que la réponse à l’E2 est perdue lorsqu’une mutation est introduite au niveau des sites de liaisons des récepteurs nucléaires NUR77 et SF1. Enfin, nous démontrons que l’effet de l’exposition à l’E2 peut être renversé par un traitement conjoint avec de la testostérone, un activateur de la transcription d’Insl3. Malheureusement, les travaux n’ont pu être complétés dans le cadre de la présente thèse puisque la lignée cellulaire utilisée comme modèle, la lignée MA-10, a cessé de répondre aux divers stimuli. Néanmoins, les données présentées procurent d’importantes nouvelles perspectives sur la régulation de la transcription d’Insl3/INSL3 dans les cellules de Leydig, sur le mode d’action des phtalates et suggèrent des pistes de recherche à venir. La présente thèse contribue ainsi à la somme des savoirs qui permettra de comprendre comment le DEHP vient inhiber la sécrétion de T et d’INSL3.

Les cellules de Leydig constituent la principale source de testosterone. Elles sont essentielles à la différenciation sexuelle et à la masculinisation de même qu'à l'initiation et au maintien de la spermatogenèse. La différenciation des cellules de Leydig requiert le récepteur PDGF-Rα, localisé à leur membrane, et son ligand PDGF-A, synthétisé par les cellules de Sertoli. À ce jour, aucune information n'est disponible concernant les mécanismes de régulation de l'expression de PDGF-Rα dans les cellules de Leydig. Afin de caractériser ces mécanismes, un fragment de 2 kb du promoteur Pdgfra de rat a été isolé et fusionné au gène rapporteur luciférase. Une série de deletions 5' progressive du promoteur a ensuite été générée. Des transfections transitoires de ces constructions promotrices Pdgfra dans la lignée TM3 de cellules de Leydig ont mis en évidence une région de 49 pb qui compte pour 60% de l'activité promotrice. Afin de mieux circonscrire les éléments régulateurs critiques à l'intérieur de cette région, une série de 12 mutants de 3 pb a été réalisée par mutagenèse dirigée. Ces 12 mutants ont permis d'identifier une courte séquence de 20 pb qui joue un rôle clé dans l'activité promotrice. Des analyses de retardement sur gel ont détecté la liaison de protéines nucléaires à cet élément. Différentes approches, dont une de protéomique, ont ensuite été employées afin d'élucider la nature du/des facteurs de transcription qui se lient à cette région du promoteur Pdgfra et elles ont entre autres démontré que le facteur SPI régule positivement l'activité de ce promoteur. L'étude de la régulation de Pdgfra permettra de mieux comprendre le processus de différenciation des cellules de Leydig.

L’hormone peptidique Insulin-like 3 (INSL3) est produite par les cellules de Leydig du testicule. Elle est essentielle à la première phase de la descente testiculaire lors du développement fœtal. Les divers modèles animaux invalidés en Insl3 présentent une descente testiculaire incomplète chez les mâles, la cryptorchidie. Il s’agit du trouble développemental le plus courant chez les garçons nouveau nés des pays industrialisés et son incidence s’est accrue au cours des dernières décennies. Plusieurs études animales indiquent que les estrogènes répriment l’expression d’Insl3. La répression de l’expression d’Insl3 implique probablement le récepteur alpha des estrogènes (ERα) et/ou le récepteur nucléaire Nr0b2, tous deux présents dans les cellules de Leydig. En vue de vérifier la répression d’Insl3 par les estrogènes et d’impliquer ERα et/ou Nr0b2, j’ai analysé l’activité promotrice d’Insl3 murin par transfection et j’ai étudié les variations d’expression de son ARNm en PCR quantitatif. J’ai pu vérifier la répression d’Insl3 par l’estradiol et Nr0b2 ne parait pas être impliqué. L’implication d’ERα semble probable, mais les résultats de techniques différentes sont contradictoires.

La fonction et la différenciation des cellules de Leydig sont connues pour être régulées par différents stimuli incluant 1' hormone lutéinisante (LB) et autres facteurs paracrines et autocrines comme les cytokines dont 1 ' IL-1. NUR 77 est un facteur de transcription présent au niveau des cellules de Leydig et impliqué dans la régulation de la stéroïdogenèse. Malgré que Nur77 soit connu pour être régulé par les cytokines dans différents types cellulaires, cette régulation n 'est pas encore bien caractérisée au niveau des cellules de Leydig. Afin de mieux comprendre la régulation de Nur77 par les cytokines, j ' ai décidé d'étudier l' effet de deux facteurs de transcription, C/EBP~ et NF -KB, connus pour être impliqués dans les voies de signalisation des cytokines, sur le promoteur Nur77. J'ai trouvé que les facteurs de transcription C/EBP~ et NF -KB coopèrent ensemble dans l'activation du promoteur Nur77. Cette coopération nécessite la présènce d'au moins un des deux éléments nouvellement identifiés dans cette étude : C/EBP~ (à -110 pb en fonction du site d'initiation de la transcription) ou p50 (KB à -18 pb). L'activation du promoteur Nur77 par ces facteurs de transcription appuie mon hypothèse selon laquelle NUR 77 peut être un effecteur dans la voie de signalisation des cytokines comme 1 'IL-l.

L'enzynle HSD3B2 humaine et la protéine STAR de souris encodées par les gènes HSD3B2 et Star, respectivement, sont retrouvées principalement au niveau des gonades et surrénales. L'importance de STAR comme transporteur du cholestérol et de HSD3B2 comme enzyme de la stéroïdogenèse est lnise en évidence par des mutations de ces gènes causant une hyperplasie congénitale des surrénales, un pseudohermaphrodisme mâle et une insuffisance des surrénales. Un rôle pour la famille de récepteurs nucléaires orphelins NUR 77 dans la stéroïdogenèse a été considéré. En effet, NUR77 est présent dans les gonades et surrénales où son expression est fortement et rapidement induite par des horlnones qui activent certains gènes impliqués dans la stéroïdogenèse. De plus, les profils d'expression de Nur77 et des gènes RSD3B2 et Star sont corrélés. Lors de cette thèse, j'ai démontré que les promoteurs HSD3B2 et Star constituent des nouvelles cibles de NUR77. Des éléments de réponse localisés à -130 pb et -95 pb des promoteurs HSD3B2 et Star respectivement, sont essentiels et suffisants pour conférer une réponse dépendante de NUR77, et la mutation de ces élélnents . diminue leurs activités basale et homlono-dépendante dans les cellules stéroïdogéniques. Dans les cellules de Leydig, un réduction de l'expression de Nur77 par siARN réduit l'induction de l'expression de Star par l'AMPc. Également, NUR77 coopère avec des co activateurs de la famille SRC et avec des membres de la famille AP-1 dans la régulation des promoteurs RSD3B2 et Star, respectivement. De plus, le dexaméthasone, un glucocorticoïde synthétique, inhibe l'activation de Star en diminuant le recrutement de NUR77, et non SF-I, à la région proximale du promoteur Star, donnant un argument moléculaire à la suppression causée par le stress de la production de testostérone dans le testicule. J'ai démontré que la voie de signalisation des CaMK est requise pour l'expression de STAR et NUR77 en réponse à l'AMPc dans les cellules de Leydig. Ainsi, CaMKI est spécifiquement exprimé dans les cellules de Leydig. Enfin, je démontre que CaMKI coopère avec NUR 77 et MEF2 pour activer les promoteurs Star et Nur77, respectivement, dans ces cellules. Ainsi, l'identification de NUR 77 comme régulateur important des promoteurs HS1J3B2 et Star et de son mécanisme d'action aident à mieux défénir la spécificité tissulaire et la régulation hormonale de ces gènes dans les cellules de Leydig en plus de soulever un rôle pour CaMKI dans ce processus.