Neuropathische Schmerzen treten in der klinischen Praxis häufig auf und beeinträchtigen in hohem Maße die Lebensqualität der Patienten. Bedingt durch eine Schädigung somatosensorischer Nervenstrukturen im peripheren oder zentralen Nervensystem ist der Schmerz meist durch eine Allodynie, Hyperalgesie oder einschießende Schmerzen charakterisiert. Diese Symptome lassen sich durch gängige Schmerzmittel kaum lindern. In jüngerer Zeit rückte die Blut-Rückenmarkschranke immer mehr in den Fokus verschiedener Untersuchungen, da auch einige nicht-schmerzhafte Erkrankungen (z.B. Multiple Sklerose und Amyotrophe Lateralsklerose) zur Veränderung dieser Barriere mit folgender Permeabilitätserhöhung durch reduzierte Tight Junction-Protein-Expression führen. Die Blut- Rückenmarkschranke dichtet Gefäße des Rückenmarks ab und verhindert das Eindringen toxischer oder proanalgetischer Mediatoren in das zentrale Nervensystem. Dafür ist die Funktion der Tight Junction-Proteine zur Aufrechterhaltung dieser Barriere essentiell. Dennoch konnte die Rolle der Blut-Rückenmarkschranke bei Neuropathie noch nicht vollständig erörtert werden. Die Untersuchungen meiner Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass eine lockere Ligatur des N. ischiadicus bei Ratten (CCI; chronic constriction injury) zur Entwicklung einer thermischen und mechanischen Hyperalgesie sowie eingeschränkten motorischen Funktionen führt. Zudem konnte eine Störung der Blut-Rückenmarkschranke nach einer CCI nachgewiesen werden, da es Tracern unterschiedlicher molekularer Größe möglich war das Rückenmark zu penetrieren. Daher sollte im Rahmen dieser Dissertation untersucht werden, inwieweit es zu einer Veränderung unterschiedlicher Tight Junction-Proteine nach peripherer Nervenverletzung (CCI) kommt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine CCI zu einer Herabregulation der mRNA-Expression von Claudin-1, Claudin-19, Tricellulin und Occludin im Rückenmark führt, wobei diese Veränderungen insbesondere 7 und 14 d nach der CCI auftraten. Die membranäre Expression dieser Proteine im Rückenmark blieb bis auf Occludin unverändert, das 7 d nach der CCI signifikant reduziert war. Am deutlichsten waren jedoch Claudin-5 und ZO-1 verändert. Folglich vermindert eine CCI signifikant die Claudin-5-mRNA sowie die Immunreaktivität in isolierten Kapillaren des Rückenmarks. Das Ankerprotein ZO-1 war sogar auf allen Ebenen, also in der Genals auch Proteinexpression, und darüber hinaus in den Rückenmarkskapillaren signifikant reduziert. Die Interpretation dieser Ergebnisse legt nahe, dass ZO-1, und zum Teil auch Claudin-5, für die gestörte Blut-Rückenmarkschranke verantwortlich sind und die anderen untersuchten Proteine vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Die Bedeutung der Tight Junction-Proteine in der Blut-Rückenmarkschranke konnte somit weiter untermauert werden. In zukünftigen Untersuchungen wäre es wichtig den Signalweg, der zur Veränderung der Tight Junction-Proteine führt sowie die subzelluläre Lokalisation zu untersuchen, um Möglichkeiten zum Wiederverschluss der Barriere zu finden. Somit könnten Therapien zur Aufrechterhaltung der Blut- Rückenmarkhomöostase den neuropathischen Schmerz unter Umständen kausal, und nicht nur symptomatisch, behandelbar machen. / Chronic neuropathic pain is common in clinical practice and it greatly impairs the quality of life of patients. Due to a lesion or disease of the peripheral or central nervous system neuropathic pain is characterized by allodynia, hyperalgesia and spontaneous pain. The treatment of neuropathic pain remains a challenge since conventional pain treatment is not effective in alleviating most types of neuropathic pain. Lately a lot of research has focussed on the function of the blood-spinal cord barrier (BSCB) since some non-painful diseases (e.g. multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis) compromise the barrier and lead to reduced tight junction protein expression. The BSCB prevents leakage of molecules such as pronociceptive and toxic mediators into the spinal cord. Tight junction proteins are essential in maintaining this barrier by restricting the paracellular diffusion pathway. Nevertheless, the pathophysiology of neuropathic pain is not completely understood. Recently, this scientific work group observed that rats with a loose ligation of the sciatic nerve (CCI) developed thermal and mechanical hypersensitivity and reduced motor performance. The BSCB became permeable for small and large tracers indicating a breakdown of the barrier. This study was therefore designed to explore selected tight junction proteins after nerve injury using CCI. The mRNA expression of claudin-1, claudin-19, tricellulin and occludin was significantly reduced at 7 and 14 days after CCI. No alteration in protein expression was observed at any chosen time point except for occludin which was significantly decreased 7 days after CCI. In addition, CCI leads to a reduction of tight junction proteins most pronounced for claudin-5 an ZO-1. Claudin-5 mRNA expression and immunoreactivity in spinal cord capillaries is significantly reduced after CCI. The anchor protein ZO-1 is even downregulated at mRNA and protein levels in the whole lumbar spinal cord as well as in the spinal cord capillaries. In conclusion, this research shows that ZO-1 and in part claudin-5 are necessary for maintaining the BSCB while other tight junction proteins possibly play a minor role for the tightness of the barrier. These results further emphasize the importance of tight junction proteins in the BSCB. In future research the signaling pathway and regulation of these tight junction proteins should be explored as barrier sealing could be a possibility for pain relief in the future.

published_or_final_version / Zoology / Doctoral / Doctor of Philosophy

Neonatal necrotizing enterocolitis (NEC) is the most common gastrointestinal disease in premature babies. Despite significant morbidity and mortality, the cause of this disease remains unclear and there are no preventative treatments available. Prematurity and enteral feeding of infant formula are considered to be the primary risk factors for development of NEC. Interestingly, the incidence of NEC is six to ten times lower in breast-fed babies compared to those that were formula-fed. The factors responsible for the protective effect of breast milk against NEC have not been identified, but epidermal growth factor (EGF) is one of the most promising candidates. EGF is found at high concentrations in human milk, but is not present in any commercial formula. Mothers with extremely premature babies have 50-80% higher levels of EGF in their breast milk compared to mothers with full term infants. This suggests that EGF plays an important role in the development of premature infants. Our studies have shown that supplementation of EGF into formula significantly reduces the incidence of NEC in a neonatal rat model. However, the mechanisms underlying this EGF-mediated reduction of NEC are not understood. The overall hypothesis of this dissertation is that the protective effect of EGF in NEC pathogenesis is mediated via increased expression of pro-survival genes and strengthening of the mucosal barrier. The results of the studies within this dissertation demonstrate that treatment with EGF significantly decreases intestinal epithelial cell apoptosis at the site of NEC injury by up-regulating anti-apoptotic genes and down-regulating pro-apoptotic genes. Furthermore, supplementation of formula with EGF strengthens the mucosal barrier by inducing accelerated maturation of ileal goblet cells and mucin-2 production. In addition, EGF treatment normalizes expression of crucial tight junction proteins in the ileum. Consequently, EGF treatment results in a significant decrease in intestinal paracellular permeability and improved barrier function. Results from these studies will provide significant contributions to the understanding of EGF-mediated reduction of NEC, which may lead to development of therapeutic strategies for the treatment of human NEC.

Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Für die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundgerüst und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen Überstände wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antikörper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivität gegenüber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antikörper gegen alle 4 extra- und intrazellulären Domänen zu gewinnen. Mit diesen Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranständiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von natürlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschränkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabhängig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivität von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 während der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegenüber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranständige Färbung, sondern nur noch zytoplasmatische Färbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 Färbung in einer größeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression während der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgeführt. In den adhärenten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erhöhung der Apoptose führt. Die parazellulären Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazelluläre Flux zwischen den Zellen deutlich zurückgeht. Somit könnte die reduzierte Wachstumskapazität bzw. erhöhte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zugänglichkeit von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies würde auch erklären, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. Während in Organen und Drüsengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. Wären die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so könnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. Für das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellulären Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber möglich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabhängig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden. / Two years ago probably the most important tight junction proteins in mice were identified: claudin-1 and -2 . By sequence homology up to 18 members could be assigned to this 4 transmembrane protein family. The human claudin-1 with a 91 per cent sequence similarity to the murine claudin-1 was isolated in parallel (Swisshelm et al. 1999) and it has been shown that most breast cancer cell lines lost the expression of hu-CLDN1. The goal of this Ph. D. thesis was the evaluation of the cell physiological function of the human Claudin-1 (hu-CLDN1) and its relevance during tumorigenesis. To investigate the protein expression and cellular homing monoclonal antibodies using DNA vaccination were generated. The antibodies were analyzed for hu-CLDN1 specifity by Western blot and the epitope binding sites were identified by a competetive hu-CLDN1 peptide ELISA. Using the monoclonal antibodies optimal immunocytochemical and immunohistochemical methods for biological methods were established. With these antibodies the cellular expression and localization, and the expression of hu-CLDN1 in tissue slices of tumor versus normal tissues was analyzed. For the reexpression of hu-CLDN1 in breast tumor cells, retroviral shuttle systems were generated, based on a MoMuLV backbone using the l-NGFR receptor for efficient and rapid transduction of breast cancer cells with hu-CLDN1. For this purpose a mock vector (containing l-NGFR only ) and a hu-CLDN1 vector with l-NGFR were cloned. The expression of hu-CLDN1 in various breast cancer cell lines was analysed using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT PCR). The monoclonal antibodies against hu-CLDN1 are specific against hu-CLDN1. In addition antibodies for all 4 extra- and cytosolic domains were generated. Using these antibodies it was shown by immunofluorescence microscopic analysis that hu-CLDN1 is an exclusively membrane located protein. The expression of the protein is detectable only in confluent cell cultures of naturally hu-CLDN1 expressing cell lines (T47-D, MCF7) and only in the areas of direct cell cell contact. The transduction of hu-CLDN1 negative cell lines analyzed by qRT PCR displayed a mRNA expression in subconfluent and confluent cell cultures, while the protein was only detectable in confluent cell cultures. This indicates that the hu-CLDN1 negative breast tumor cell lines still have the intact signal transduction pathway for the correct expression with an up to now unknown posttranscriptional control mechanism of protein expression. In this context it is noteworthy that even occludin and ZO-1 negative breast tumor cell lines (e. g. MDA-MB-435) still have the physiological homing mechanism of hu-CLDN1. Therefore it can be suggested that expression and homing at hu-CLDN1 might be independent of occludin and ZO-1. The analysis of different hu-CLDN1 positive and negative breast tumor cells showed that the loss of expression of hu-CLDN1 correlates more significantly to the tumorigenesis of cells in comparison to occludin and ZO-1. The clinical relevance of the downregulation and loss of hu-CLDN1 was analyzed using expression analysis of breast and colon tissue versus tumor tissue on tissue microarrays. Normal breast tissue displayed a epithelial/endothelial hu-CLDN1 membrane localization only. None of the breast tumor tissue displayed a membrane localization of the hu-CLDN1 however a relocalization to the cytoplasm was evident. Additionally a significant reduction or loss of expression could be detected in the majority of tumor tissues. These results show that the loss of expression of hu-CLDN1 in breast and colon tumors correlates with tumor progression. In order to analyze the relevance of hu-CLDN1 relocalization and reduction of expression during tumorigenesis on a cellphysiological level, in vitro cell culture studies were performed using hu-CLDN1 negative cell lines (MDA-MB-361) and their hu-CLDN1 transduced counterparts. Hu-CLDN1 transduced cells growing in 2 D cell cultures displayed no altered growth or increased levels of apoptosis. However in three dimensional growing tumor cell aggregates the reexpression of hu-CLDN1 results in a significantly increased induction of apoptosis. In addition paracellular flux analysis revealed that reexpression of hu-CLDN1 decreased the paracellular flux significantly. This data suggests that the reduced growth and increased apoptosis in hu-CLDN1 positive tumor cell aggregates could be due to reduced accessibility of growth factors in hu-CLDN1 transduced cell aggregates. This would explain the necessity for the cytoplasmic homing and loss of expression of hu-CLDN1 during tumorprogression in breast and colon tumors. Most epithelia exist as single layers in organs and lobular structures resulting in a good accessibility of growth factors via diffusion or micro-/macropinocytosis. However, carcinoma tumor cells grow in multilayers. Intact tight junction complexes in carcinoma multi layers would result in a reduced accessibility of growth factors and nutrients. Therefore it is suggested that it is essential for the in vivo growth of a tumor to decrease the expression of tight junctions regulating the paracellular flux. According to the molecular and cell physiological studies presented it might be possible to achieve a tumor inhibiting effect by re-expression of hu-CLDN1. Therefore at least from a cell physiological point of view hu-CLDN1 can be considered to be a tumor suppressor protein.

Untersuchung des transepithelialen Widerstands, der Transkriptionsmenge und der fluoreszenzmikroskopischen Verteilung der Proteine Occludin und ZO-1 in Monolayern in Reaktion auf exogene Faktoren. / Trials of Occludin and ZO-1 in an epithelial model by measure the transepithelial resistance, the transcriptionlevel and the microskopic distibution.

Rund 300 Millionen Alveolen sorgen in der menschlichen Lunge für den Gasaustausch. Eine essentielle Rolle spielen dabei die Alveolarepithelzellen, die die erste Barriere der Luft gegenüber dem Blut bilden. Man unterteilt diese in die kubisch förmigen Typ-II-Epithelzellen, die den wichtigen stabilisierenden Surfactant bilden und in die flacheren Typ-I-Zellen, die aufgrund von engen Zell-Zell Kontakten miteinander eine funktionelle Barriere zwischen Luft und Blut (Blut-Luft-Schranke) ermöglichen. In der Pathophysiologie von verschiedenen Lungenerkrankungen, wie z.B. dem ARDS, spielt die Störung dieser Barriere eine essentielle Rolle. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es, ein in vitro-Modell dieser Barriere, basierend auf der humanen Epithellzelllinie NCI H441, zu etablieren. Die Epithelzellen wurden hierzu erfolgreich auf Transwelleinsätzen gezüchtet. Um die Barriereeigenschaften zu überprüfen, wurden mit TER Messungen und Fluoreszenzpermeabilitätsmessungen zwei verschiedene Verfahren eingesetzt. Für die Bewahrung der Konfluenz wurden die Zellen mit Dexamethason – einem potenten Glukokortikoid – behandelt. Dexamethason wurde idealerweise bei jedem Medienwechsel ab Tag 5 apikal hinzugefügt und zeigte einen barrierefördernden Effekt. Die optimale hinzugefügte Dexamethason–konzentration erwies sich als 100 nM. Hierunter bildete die Zellschicht – sowohl mittels TER-Messung als auch mittels Fluoreszenzpermeabilitätsmessung überprüft – eine starke Barriere aus, die am Tag 14-15 nach Zellaussaat ihr Maximum erreichte. Auf mRNA Ebene konnten zu diesem Zeitpunkt unter 100 nM Dexamethason jeweils relevante Mengen zellspezifischer Proteine von Alveolarepithelzellen Typ-I und II nachgewiesen werden. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie konnte zusätzlich visualisiert werden, dass die zwei Zelltypen koexistieren. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte sich weiterhin ein ausgeprägtes Netz an Occludensjunktionsproteinen (Claudin -1,-3,-4, Occludin, ZO-1). In weiteren Versuchen wurde der Einfluß von Endothelzellfaktoren auf das epitheliale Lungenkulturmodell untersucht. Es zeigte sich ein stark ausgeprägter gewebsspezifischer Effekt: Die Faktoren der Lungenendothelzellen stärkten die Barriere des Modells, hingegen die Hirnendothelzellfaktoren sie stark schwächten. Dieser Effekt zeigte sich sowohl durch die gemessenen TER-Werte als auch durch die gemessenen Fluoreszeinpermeabelitätswerte. Erste Belastungsversuche des Modell durch Hypoxie und reaktive Sauerstoffspezies zeigten eine gewisse Widerstandsfähigkeit der Barriere gegenüber Noxen. Das vorliegende Zellkulturmodell des Lungenalveolarepithels, basierend auf der NCI H441 Zelllinie, kann folglich genutzt werden, um die Regulation der Barriere genauer zu erforschen und mögliche neue Therapiestrategien zu entwickeln. / The blood–air barrier in the lung consists of the alveolar epithelium, the underlying capillary endothelium, their basement membranes and the interstitial space between the cell layers. Within the framework of this thesis an in vitro-Transwell model of the alveolar epithelium based on human cell line H441 was established and the influence of conditioned medium obtained from human lung endothelial cell line HPMEC-ST1.6R on the barrier properties of the H441 layers were investigated. As control for tissue specificity H441 layers were exposed to conditioned medium from human brain endothelial cell line hCMEC/D3. Addition of dexamethasone was necessary to obtain stable H441 cell layers. Moreover, dexamethasone increased expression of cell type I marker caveolin-1, and cell type II marker SP-B, whereas decreased the transepithelial electrical resistance (TEER) in a concentration dependent manner. Soluble factors obtained from the lung endothelial cell line increased the barrier significantly proven by TEER values and fluorescein permeability on the functional level and by the differential expression of tight junctional proteins on the molecular level. In contrast to this, soluble factors derived from brain endothelial cells weakened the barrier significantly. In conclusion, soluble factors from lung endothelial cells can strengthen the alveolar epithelium barrier in vitro, which suggests communication between endothelial and epithelial cells regulating the integrity of the blood–air barrier. With regard to the clinical context, influencing the alveolar permeability may be a future target in the treatment of different lung diseases such as ARDS and this in-vitro model may be a helpful tool for it.

Tight-binding potential combined with a simulated annealing method is used to study the generalized stacking fault structure and energy of gold. The potential is chosen to fit band structures and total energies from a set of first-principles calculations (Phys. Rev. B54, 4519 (1996)). It is found that the relaxed stacking fault energy (SFE) and anti-SFE are equal to 46 and 102 mJ/m², respectively, and in good agreement with the first principles calculations and experiment. In addition, the potential predicts that the c/a of hcp-like stacking fault structure in Au is slightly smaller than the ideal one. / Singapore-MIT Alliance (SMA)

Tight gas reservoirs are those reservoirs where the matrix has a low permeability range (k < 0.1 md). The literature documents laboratory experiments under restressed conditions that show stress dependent rock properties are more significant in tighter rocks. For gas reservoirs, real gas properties are also sensitive to variations of pressure, and the correct description of gas flow must include pressure-dependent gas properties. Under these circumstances the resulting equation for real gas flow is a second order, non-linear, partial differential equation. Non-linearities include pressure-dependence of gas viscosity, gas compressibility, reservoir permeability and reservoir porosity. This paper investigates dynamic permeability change as a function of net overburden stress in tight gas reservoirs. The gas reservoir simulator used for this work included pressure-dependent reservoir permeability. Radial flow cases are analyzed using this simulator. During this study we found that from analysis of production data alone, it is impossible to determine the correct permeability value for tight gas reservoirs with pressure-dependent permeability. For the cases studied, the transient performance was similar for both constant permeability and pressure-dependent permeability. This similarity causes constant permeability and pressure-dependent permeability to be indistinguishable, based on analysis of transient performance data. It was found that the productivity index decreases when pressure-dependent permeability is more significant. Finally, this study verified that the method of Ibrahim et al.28 under estimates original gas in place (OGIP) for tight gas reservoirs with pressure-dependent permeability.

The modern oil and gas industry of America has seen most of the high quality, easily obtainable resources, already produced, thus causing wells to be drilled deeper in search for unconventional resources. This means Oil Country Tubular Goods (OCTG) must improve in order to withstand harsher conditions; especially the ability of connections to effectively create leak tight seals. This study investigates the use of thread connections in tight gas fields; therefore, an insight into their potential to contribute to fulfilling the energy demands is necessary. Also, a survey of completed projects done in tight gas fields can provide vital information that will establish the minimum requirements thread connection must meet to perform its functions. To make suitable adjustments to ensure safe and efficient operations we must thoroughly understand the many aspects of thread connections. To have this understanding, a review of previous works was carried out that highlights the capabilities and imitations of thread connections. In addition to reviewing previous work done on thread connections; this study measured the viscosity of thread compounds under variable conditions. It was found that viscosity of thread compound falls in the range of 285,667 cP and 47,758 cP when measured between 32.9 degrees F and 121.5 degrees F. This can be very important because thread compound is essential to the function of thread connections. The knowledge of its viscosity can help choose the most suitable compound. By knowing the value of the viscosity of a thread compound it can also be used to form an analytical assessment of the grooved plate method by providing a means to calculate a pressure gradient which impacts the leakage.

As the demand for energy worldwide increases, the oil and gas industry will need to increase recovery from unconventional gas reservoirs (UGR). UGRs include Tight Gas Sand (TGS), coalbed methane and gas shales. To economically produce UGRs, one must have adequate product price and one must use the most current technology. TGS reservoirs require stimulation as a part of the completion, so improvement of completion practices is very important. We did a thorough literature review to extract knowledge and experience about completion and stimulation technologies used in TGS reservoirs. We developed the principal design and two modules of a computer program called Tight Gas Sand Advisor (TGS Advisor), which can be used to assist engineers in making decisions while completing and stimulating TGS reservoirs. The modules include Perforation Selection and Proppant Selection. Based on input well/reservoir parameters these subroutines provide unambiguous recommendations concerning which perforation strategy(s) and what proppant(s) are applicable for a given well. The most crucial parameters from completion best-practices analyses and consultations with experts are built into TGS Advisor’s logic, which mimics human expert’s decision-making process. TGS Advisor’s recommended procedures for successful completions will facilitate TGS development and improve economical performance of TGS reservoirs.