O timerosal é um agente antisséptico utilizado em vacinas como conservante. Devido a presença de etilmercúrio (EtHg) em sua composição (com aproximadamente 49% de mercúrio (Hg) em peso), uma preocupação existe em relação aos possíveis efeitos tóxicos em humanos. No entanto, pouco se sabe sobre o perfil cinético do EtHg em mamíferos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a distribuição tecidual e meias-vidas do Hg, seu metabolismo no sangue (conversão a mercúrio inorgânico) e nefrotoxicidade após exposição ao timerosal, utilizando modelos in vivo e in vitro. Para isto, o trabalho foi dividido em 3 estudos: (I) camundongos machos Swiss foram expostos a 20 ?g de Hg sob a forma de timerosal via intramuscular. Sangue, cérebro, coração, rim e fígado foram coletados após 0,5; 1; 8; 16; 144; 720 e 1980 horas (h) da exposição (n=4) e analisados quanto às concentrações das espécies de Hg por HPLC-ICP-MS; (II) alíquotas (n=4) de sangue total, plasma e eritrócitos humanos foram expostas a timerosal ou EtHg (3 mg/l) durante 24 h e analisadas quanto às concentrações das espécies de Hg por HPLC-ICP-MS; (III) células HK2 foram expostas durante 24 h a timerosal (0 ?M a 2 ?M) e avaliadas quanto à viabilidade e proliferação celular, apoptose, expressão de proteínas Bax e TGF-?1, saúde mitocondrial e concentrações de fibronectina no meio. Verificou-se que o transporte de EtHg do músculo para os tecidos e a sua conversão em Hg inorgânico (Hgi) ocorrem rapidamente. Após 0,5 h da exposição ao timerosal, as concentrações mais altas de ambos EtHg e Hgi foram encontradas no rins (> 70% do Hg total no corpo do animal). O cérebro apresentou uma menor contribuição para a carga corporal de Hg (<1,0% do Hg total no corpo do animal). Após trinta dias da exposição ao timerosal, houve excreção considerável de Hg e o fígado apresentou a maior parte do Hg ainda restante no corpo dos animais. As meias-vidas foram estimadas (em dias) em 8,8; 10,7; 7,8; 7,7 e 45,2; para o sangue, cérebro, coração, fígado e rim, ii respectivamente. Sugere-se que a extensão da conversão de EtHg a Hgi é modulada em parte pela partição do EtHg no plasma e no sangue, uma vez que o EtHg é rapidamente convertido a Hgi nas células vermelhas, mas não no plasma. O mecanismo de dealquilação em células vermelhas parece ser mediado pela reação de Fenton (formação de radicais hidroxil). Ainda, EtHg/timerosal diminuiu a viabilidade celular e mitose, promoveu a apoptose, prejudicou o estado de transição de permeabilidade mitocondrial, aumentou a expressão de Bax e TGF-?1 e secreção de fibronectina. Coletivamente, os resultados demonstram que a cinética do timerosal (EtHg) está mais próxima a do Hgi - e não do MeHg - e o rim deve ser considerado um alvo potencial de toxicidade do EtHg, já que é o órgão exposto às maiores concentrações de Hg , e onde o metal apresenta sua maior meia-vida biológica. Adicionalmente, o EtHg/timerosal demonstrou ser um agente antiproliferativo, apoptótico e pró-fibrótico em células humanas renais. / Thimerosal is an antiseptic agent used in vaccines as a preservative. Due to the presence of ethylmercury (EtHg) in its composition (approximately 49% mercury (Hg) by weight), there is a concern regarding possible toxic effects in humans. However, little is known about the kinetic profile of EtHg in mammals. Thus, this study aimed to evaluate the tissue distribution and half-life of Hg, its metabolism in blood (conversion to inorganic mercury) and nephrotoxicity after exposure to thimerosal, using in vivo and in vitro models. The work was divided into three studies: (I) Swiss male mice were exposed to 20 ?g of Hg in the form of thimerosal intramuscularly. Blood, brain, heart, kidney and liver were collected after 0.5, 1, 8, 16, 144, 720 and 1980 hours (h) of exposure (n=4) and analyzed for concentrations of Hg species by HPLC-ICP-MS; (II) aliquots (n=4) of whole blood, plasma and erythrocytes were exposed to thimerosal or EtHg (3 mg/l) for 24 h and analyzed for Hg species concentrations by HPLC-ICP-MS; (III) HK2 cells were exposed for 24 h to thimerosal (0 ?M to 2 ?M) and evaluated for cell viability and proliferation, apoptosis, Bax and TGF-?1 expression, mitochondrial health and concentrations of fibronectin in the medium. It has been found that the transport of EtHg from muscle to tissues and its conversion into inorganic Hg (Hgi) occur quickly. After 0.5 h of exposure to thimerosal, higher concentrations of both EtHg and Hgi were found in the kidneys (> 70% of total Hg in the animal body). The brain showed a minor contribution to the body burden of Hg (<1.0% of total Hg in the animal body). Thirty days after exposure to thimerosal, there was considerable excretion of Hg and liver had the most Hg still remaining in the animal body. Half-lives were estimated (in days) at 8.8; 10.7; 7.8; 7.7 and 45.2; for blood, brain, heart, liver and kidney, respectively. It is suggested that the extent of conversion of the EtHg into Hgi is modulated in part by the partition of EtHg in plasma and blood, since EtHg is rapidly converted into Hgi in red cells but not in plasma. The mechanism of dealkylation in red cells seems to be mediated by the Fenton reaction iv (formation of hydroxyl radicals). Additionally, EtHg/thimerosal decreased cell viability and mitosis, promoted apoptosis, impaired mitochondrial permeability transition state, increased expression of Bax and TGF-?1 and fibronectin secretion in the media. Collectively, the results demonstrate that the kinetics of thimerosal (EtHg) is closer to the Hgi - and not the MeHg - and kidney should be considered a potential target for EtHg toxicity, since it is exposed to the highest concentrations of Hg and it is the tissue where the metal has a greater biological half-life. Additionally, EtHg/thimerosal was shown to be an antiproliferative, apoptotic and pro-fibrotic agent in human kidney cells.

O timerosal é um agente antisséptico utilizado em vacinas como conservante. Devido a presença de etilmercúrio (EtHg) em sua composição (com aproximadamente 49% de mercúrio (Hg) em peso), uma preocupação existe em relação aos possíveis efeitos tóxicos em humanos. No entanto, pouco se sabe sobre o perfil cinético do EtHg em mamíferos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a distribuição tecidual e meias-vidas do Hg, seu metabolismo no sangue (conversão a mercúrio inorgânico) e nefrotoxicidade após exposição ao timerosal, utilizando modelos in vivo e in vitro. Para isto, o trabalho foi dividido em 3 estudos: (I) camundongos machos Swiss foram expostos a 20 ?g de Hg sob a forma de timerosal via intramuscular. Sangue, cérebro, coração, rim e fígado foram coletados após 0,5; 1; 8; 16; 144; 720 e 1980 horas (h) da exposição (n=4) e analisados quanto às concentrações das espécies de Hg por HPLC-ICP-MS; (II) alíquotas (n=4) de sangue total, plasma e eritrócitos humanos foram expostas a timerosal ou EtHg (3 mg/l) durante 24 h e analisadas quanto às concentrações das espécies de Hg por HPLC-ICP-MS; (III) células HK2 foram expostas durante 24 h a timerosal (0 ?M a 2 ?M) e avaliadas quanto à viabilidade e proliferação celular, apoptose, expressão de proteínas Bax e TGF-?1, saúde mitocondrial e concentrações de fibronectina no meio. Verificou-se que o transporte de EtHg do músculo para os tecidos e a sua conversão em Hg inorgânico (Hgi) ocorrem rapidamente. Após 0,5 h da exposição ao timerosal, as concentrações mais altas de ambos EtHg e Hgi foram encontradas no rins (> 70% do Hg total no corpo do animal). O cérebro apresentou uma menor contribuição para a carga corporal de Hg (<1,0% do Hg total no corpo do animal). Após trinta dias da exposição ao timerosal, houve excreção considerável de Hg e o fígado apresentou a maior parte do Hg ainda restante no corpo dos animais. As meias-vidas foram estimadas (em dias) em 8,8; 10,7; 7,8; 7,7 e 45,2; para o sangue, cérebro, coração, fígado e rim, ii respectivamente. Sugere-se que a extensão da conversão de EtHg a Hgi é modulada em parte pela partição do EtHg no plasma e no sangue, uma vez que o EtHg é rapidamente convertido a Hgi nas células vermelhas, mas não no plasma. O mecanismo de dealquilação em células vermelhas parece ser mediado pela reação de Fenton (formação de radicais hidroxil). Ainda, EtHg/timerosal diminuiu a viabilidade celular e mitose, promoveu a apoptose, prejudicou o estado de transição de permeabilidade mitocondrial, aumentou a expressão de Bax e TGF-?1 e secreção de fibronectina. Coletivamente, os resultados demonstram que a cinética do timerosal (EtHg) está mais próxima a do Hgi - e não do MeHg - e o rim deve ser considerado um alvo potencial de toxicidade do EtHg, já que é o órgão exposto às maiores concentrações de Hg , e onde o metal apresenta sua maior meia-vida biológica. Adicionalmente, o EtHg/timerosal demonstrou ser um agente antiproliferativo, apoptótico e pró-fibrótico em células humanas renais. / Thimerosal is an antiseptic agent used in vaccines as a preservative. Due to the presence of ethylmercury (EtHg) in its composition (approximately 49% mercury (Hg) by weight), there is a concern regarding possible toxic effects in humans. However, little is known about the kinetic profile of EtHg in mammals. Thus, this study aimed to evaluate the tissue distribution and half-life of Hg, its metabolism in blood (conversion to inorganic mercury) and nephrotoxicity after exposure to thimerosal, using in vivo and in vitro models. The work was divided into three studies: (I) Swiss male mice were exposed to 20 ?g of Hg in the form of thimerosal intramuscularly. Blood, brain, heart, kidney and liver were collected after 0.5, 1, 8, 16, 144, 720 and 1980 hours (h) of exposure (n=4) and analyzed for concentrations of Hg species by HPLC-ICP-MS; (II) aliquots (n=4) of whole blood, plasma and erythrocytes were exposed to thimerosal or EtHg (3 mg/l) for 24 h and analyzed for Hg species concentrations by HPLC-ICP-MS; (III) HK2 cells were exposed for 24 h to thimerosal (0 ?M to 2 ?M) and evaluated for cell viability and proliferation, apoptosis, Bax and TGF-?1 expression, mitochondrial health and concentrations of fibronectin in the medium. It has been found that the transport of EtHg from muscle to tissues and its conversion into inorganic Hg (Hgi) occur quickly. After 0.5 h of exposure to thimerosal, higher concentrations of both EtHg and Hgi were found in the kidneys (> 70% of total Hg in the animal body). The brain showed a minor contribution to the body burden of Hg (<1.0% of total Hg in the animal body). Thirty days after exposure to thimerosal, there was considerable excretion of Hg and liver had the most Hg still remaining in the animal body. Half-lives were estimated (in days) at 8.8; 10.7; 7.8; 7.7 and 45.2; for blood, brain, heart, liver and kidney, respectively. It is suggested that the extent of conversion of the EtHg into Hgi is modulated in part by the partition of EtHg in plasma and blood, since EtHg is rapidly converted into Hgi in red cells but not in plasma. The mechanism of dealkylation in red cells seems to be mediated by the Fenton reaction iv (formation of hydroxyl radicals). Additionally, EtHg/thimerosal decreased cell viability and mitosis, promoted apoptosis, impaired mitochondrial permeability transition state, increased expression of Bax and TGF-?1 and fibronectin secretion in the media. Collectively, the results demonstrate that the kinetics of thimerosal (EtHg) is closer to the Hgi - and not the MeHg - and kidney should be considered a potential target for EtHg toxicity, since it is exposed to the highest concentrations of Hg and it is the tissue where the metal has a greater biological half-life. Additionally, EtHg/thimerosal was shown to be an antiproliferative, apoptotic and pro-fibrotic agent in human kidney cells.

Interaction between bovine serum albumin (BSA) and thimerosal (TM), organic mercury compound, was investigated by spectroscopic methods. The results, by molecular fluorescence, show that the interaction takes place by static quenching with electrostatic forces spontaneously (ΔG = - 4.40 kJ mol-1 at 30°C). The binding constant (Kb) was 3.24 ± 0.01x103 L mol-1 (30°C) is considered a moderate interaction. Fluorescence in three dimensions revealed that TM causes structural involving the the polypeptide chain BSA changes in the polarity of the tryptophan and tyrosine residues confirmed by circular dichroism (CD) showed an increase in α-helix content after interaction with TM. In addition, the TM decreases the surface hydrophobicity of the protein. Bilirubin was used as a marker for the subdomain IB, confirming that TM interacts in this region of the protein. The study of the interaction mechanism proposed that TM is reacted with BSA through the free cysteine residue, forming the adduct BSA-HgEt release of thiosalicylic acid (ATS), which interacts with amino acids with side chain positive. Besides, it was seen that TM accelerates the protein fibrillation kinetics by 42%, with a possible indication of the toxicity of this compound in biological systems. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A interação entre albumina do soro bovino (BSA) e timerosal (TM), composto orgânico de mercúrio, foi investigada utilizando métodos espectroscópicos. Os resultados, por fluorescência molecular, evidenciam que a interação acontece por quenching estático através de forças eletrostáticas de forma espontânea (ΔG = - 4,40 kJ mol-1 a 30ºC). A constante de ligação (Kb) foi de 3,24 ± 0,01x103 L mol-1 (30ºC) sendo considerada uma interação moderada. A fluorescência em três dimensões revelou que TM causa mudanças estruturais envolvendo a cadeia polipeptídica da BSA assim como altera a polaridade dos resíduos de triptofano e tirosina, confirmada por dicroísmo circular (DC) que evidenciou aumento no conteúdo de α-hélice após interação com TM. Além disto, TM diminui a hidrofobicidade superficial da proteína. Bilirrubina foi utilizada como marcador para o subdomínio IB, confirmando que TM interage nesta região da proteína. O estudo do mecanismo de interação propôs que TM reage com BSA através do resíduo de cisteína livre, formando o aduto BSA-HgEt com liberação de ácido tiosalicílico (ATS), que interage com os aminoácidos com cadeia lateral positiva. Por fim, foi visto que TM acelera a cinética de fibrilação proteica em 42%, sendo um possível indício da toxicidade deste composto em sistemas biológicos.