A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

O sulfito e o tiossulfato estão acumulados em tecidos e líquidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da sulfito oxidase (SO), uma enzima mitocondrial que catalisa a oxidação de sulfito derivado do metabolismo de aminoácidos sulfurados. A deficiência da SO é causada pela deficiência isolada da enzima SO ou por uma deficiência na rota de biossíntese de seu cofator molibdênio. Os indivíduos afetados por esta desordem apresentam disfunção neurológica progressiva, convulsões neonatais severas, subluxação do cristalino, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento, resultando geralmente em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico encontrado em pacientes deficientes para a SO ainda não está esclarecida, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre parâmetros de metabolismo energético e homeostase redox e mitocondrial em cérebro de ratos jovens. Inicialmente, verificamos que o sulfito inibe a atividade do complexo IV da cadeia respiratória, indicando que este composto prejudica o fluxo de elétrons, enquanto que o tiossulfato não afetou a atividade de nenhum dos complexos da cadeia respiratória em sobrenadantes de córtex cerebral. Também foi verificado que o sulfito e o tiossulfato diminuem a atividade da creatina quinase total (tCK) e de suas isoformas mitocondrial e citosólica, sugerindo que estes compostos prejudicam o tamponamento e a transferência de energia celular no cérebro. Além disso, melatonina, trolox (análogo solúvel do α-tocoferol), glutationa e o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metil éster atenuaram ou preveniram totalmente a inibição da tCK induzida por sulfito e tiossulfato, sugerindo o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nestes efeitos. O sulfito e o tiossulfato também aumentaram a oxidação da 2’,7’-diclorofluorescina e inibiram a atividade da aconitase, enquanto que somente o sulfito aumentou a produção de peróxido de hidrogênio, reforçando o envolvimento de dano oxidativo nos efeitos provocados por estes metabólitos. Contudo, a atividade da enzima Na+,K+-ATPase sináptica não foi alterada pelo sulfito e tiossulfato. Em seguida, observamos que o sulfito dissipa o potencial de membrana mitocondrial na presença de Ca2+, de forma dose-dependente de sulfito e Ca2+ em preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O sulfito também induziu inchamento e diminuiu a capacidade de retenção de Ca2+, os níveis de NAD(P)H na matriz e o imunoconteúdo de citocromo c em mitocôndrias quando Ca2+ estava presente no meio. Além disso, as alterações provocadas pelo sulfito foram prevenidas por rutênio vermelho, ciclosporina A e ADP, sugerindo que o sulfito induz transição da permeabilidade mitocondrial (MPT). Também foi verificado que dentre vários inibidores da MPT, incluindo antioxidantes, inibidores da fosfolipase A2 e o regente redutor ditiotreitol, apenas o agente alquilante de tióis N-etilmaleimida foi capaz de prevenir o inchamento mitocondrial causado por sulfito. O sulfito também diminuiu o conteúdo de grupamentos tiol de proteínas de membrana em preparações mitocondriais de cérebro, indicando que este composto age diretamente sobre grupamentos tiol contidos no poro de MPT. Assim, pode-se presumir que o prejuízo no metabolismo energético e na homeostase redox causados pelo sulfito e pelo tiossulfato e que a indução de MPT pelo sulfito podem estar envolvidos na disfunção neurológica observada nos portadores da deficiência da SO. / Sulfite and thiosulfate accumulate in tissues and biological fluids of patients affected by the deficiency of sulfite oxidase (SO), which is a mitochondrial enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite derived from the metabolism of sulfur amino acids. SO deficiency is caused by the isolated deficiency of the enzyme SO itself or by a deficiency in the biosynthetic pathway of its molybdenum cofactor. Individuals affected by this disorder present progressive neurological dysfunction, severe neonatal seizures, lens subluxation, axial hypotonia, limb hypertonicity and failure to thrive, resulting often in early childhood death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage found in SO deficient patients has not been totally established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of sulfite and thiosulfate on parameters of energy metabolism, as well as redox and mitochondrial homeostasis in rat brain. First, we verified that sulfite inhibited the activity of complex IV of the respiratory chain in cerebral cortex supernatants, indicating that this compound impairs the electron transfer flow, whereas thiosulfate did not affect any of the activities of the respiratory chain complexes. It was also found that sulfite and thiosulfate markedly decreased the activity of total creatine kinase (tCK) and its mitochondrial and cytosolic isoforms, suggesting that these compounds impair brain cellular energy buffering and transfer. Moreover, melatonin, trolox (soluble analogue of α-tocopherol), glutathione and the nitric oxide synthase inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester attenuated or fully prevented the inhibition of tCK induced by sulfite and thiosulfate, suggesting the involvement of reactive oxygen and nitrogen species in these effects. Sulfite and thiosulfate also increased 2’,7’-dichlorofluorescin oxidation and inhibited the activity of aconitase, whereas only sulfite increased hydrogen peroxide production, reinforcing the involvement of oxidative damage in the effects elicited by these metabolites. In contrast, synaptic Na+,K+-ATPase activity was not altered by sulfite and thiosulfate. Next, we observed that sulfite dissipates mitochondria membrane potential in the presence of Ca2+, in a sulfite and Ca2+ dose-dependent manner. Sulfite also induced swelling and decreased Ca2+ retention capacity, matrix NAD(P)H pool and cytochrome c immunocontent in mitochondria when Ca2+ was present in the medium. Furthermore, the alterations elicited by sulfite were prevented by ruthenium red, cyclosporine A and ADP, supporting the involvement of mitochondrial permeability transition (MPT) in these effects. It was also verified that among various MPT inhibitors, including antioxidants, phospholipase A2 inhibitors and the reductant reagent dithiothreitol, only the thiol alkylating agent N-ethylmaleimide was able to prevent the sulfite-elicited mitochondrial swelling. Moreover, sulfite decreased membrane protein thiol group content in brain mitochondria, indicating that this compound acts directly on MPT pore containing thiol groups. Taken together, it may be presumed that the mitochondrial energy and redox homeostasis impairment caused by sulfite and thiosulfate and MPT induced by sulfite may be involved in the neurological dysfunction observed in patients affected by SO deficiency.

A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

O sulfito e o tiossulfato estão acumulados em tecidos e líquidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da sulfito oxidase (SO), uma enzima mitocondrial que catalisa a oxidação de sulfito derivado do metabolismo de aminoácidos sulfurados. A deficiência da SO é causada pela deficiência isolada da enzima SO ou por uma deficiência na rota de biossíntese de seu cofator molibdênio. Os indivíduos afetados por esta desordem apresentam disfunção neurológica progressiva, convulsões neonatais severas, subluxação do cristalino, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento, resultando geralmente em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico encontrado em pacientes deficientes para a SO ainda não está esclarecida, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre parâmetros de metabolismo energético e homeostase redox e mitocondrial em cérebro de ratos jovens. Inicialmente, verificamos que o sulfito inibe a atividade do complexo IV da cadeia respiratória, indicando que este composto prejudica o fluxo de elétrons, enquanto que o tiossulfato não afetou a atividade de nenhum dos complexos da cadeia respiratória em sobrenadantes de córtex cerebral. Também foi verificado que o sulfito e o tiossulfato diminuem a atividade da creatina quinase total (tCK) e de suas isoformas mitocondrial e citosólica, sugerindo que estes compostos prejudicam o tamponamento e a transferência de energia celular no cérebro. Além disso, melatonina, trolox (análogo solúvel do α-tocoferol), glutationa e o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metil éster atenuaram ou preveniram totalmente a inibição da tCK induzida por sulfito e tiossulfato, sugerindo o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nestes efeitos. O sulfito e o tiossulfato também aumentaram a oxidação da 2’,7’-diclorofluorescina e inibiram a atividade da aconitase, enquanto que somente o sulfito aumentou a produção de peróxido de hidrogênio, reforçando o envolvimento de dano oxidativo nos efeitos provocados por estes metabólitos. Contudo, a atividade da enzima Na+,K+-ATPase sináptica não foi alterada pelo sulfito e tiossulfato. Em seguida, observamos que o sulfito dissipa o potencial de membrana mitocondrial na presença de Ca2+, de forma dose-dependente de sulfito e Ca2+ em preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O sulfito também induziu inchamento e diminuiu a capacidade de retenção de Ca2+, os níveis de NAD(P)H na matriz e o imunoconteúdo de citocromo c em mitocôndrias quando Ca2+ estava presente no meio. Além disso, as alterações provocadas pelo sulfito foram prevenidas por rutênio vermelho, ciclosporina A e ADP, sugerindo que o sulfito induz transição da permeabilidade mitocondrial (MPT). Também foi verificado que dentre vários inibidores da MPT, incluindo antioxidantes, inibidores da fosfolipase A2 e o regente redutor ditiotreitol, apenas o agente alquilante de tióis N-etilmaleimida foi capaz de prevenir o inchamento mitocondrial causado por sulfito. O sulfito também diminuiu o conteúdo de grupamentos tiol de proteínas de membrana em preparações mitocondriais de cérebro, indicando que este composto age diretamente sobre grupamentos tiol contidos no poro de MPT. Assim, pode-se presumir que o prejuízo no metabolismo energético e na homeostase redox causados pelo sulfito e pelo tiossulfato e que a indução de MPT pelo sulfito podem estar envolvidos na disfunção neurológica observada nos portadores da deficiência da SO. / Sulfite and thiosulfate accumulate in tissues and biological fluids of patients affected by the deficiency of sulfite oxidase (SO), which is a mitochondrial enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite derived from the metabolism of sulfur amino acids. SO deficiency is caused by the isolated deficiency of the enzyme SO itself or by a deficiency in the biosynthetic pathway of its molybdenum cofactor. Individuals affected by this disorder present progressive neurological dysfunction, severe neonatal seizures, lens subluxation, axial hypotonia, limb hypertonicity and failure to thrive, resulting often in early childhood death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage found in SO deficient patients has not been totally established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of sulfite and thiosulfate on parameters of energy metabolism, as well as redox and mitochondrial homeostasis in rat brain. First, we verified that sulfite inhibited the activity of complex IV of the respiratory chain in cerebral cortex supernatants, indicating that this compound impairs the electron transfer flow, whereas thiosulfate did not affect any of the activities of the respiratory chain complexes. It was also found that sulfite and thiosulfate markedly decreased the activity of total creatine kinase (tCK) and its mitochondrial and cytosolic isoforms, suggesting that these compounds impair brain cellular energy buffering and transfer. Moreover, melatonin, trolox (soluble analogue of α-tocopherol), glutathione and the nitric oxide synthase inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester attenuated or fully prevented the inhibition of tCK induced by sulfite and thiosulfate, suggesting the involvement of reactive oxygen and nitrogen species in these effects. Sulfite and thiosulfate also increased 2’,7’-dichlorofluorescin oxidation and inhibited the activity of aconitase, whereas only sulfite increased hydrogen peroxide production, reinforcing the involvement of oxidative damage in the effects elicited by these metabolites. In contrast, synaptic Na+,K+-ATPase activity was not altered by sulfite and thiosulfate. Next, we observed that sulfite dissipates mitochondria membrane potential in the presence of Ca2+, in a sulfite and Ca2+ dose-dependent manner. Sulfite also induced swelling and decreased Ca2+ retention capacity, matrix NAD(P)H pool and cytochrome c immunocontent in mitochondria when Ca2+ was present in the medium. Furthermore, the alterations elicited by sulfite were prevented by ruthenium red, cyclosporine A and ADP, supporting the involvement of mitochondrial permeability transition (MPT) in these effects. It was also verified that among various MPT inhibitors, including antioxidants, phospholipase A2 inhibitors and the reductant reagent dithiothreitol, only the thiol alkylating agent N-ethylmaleimide was able to prevent the sulfite-elicited mitochondrial swelling. Moreover, sulfite decreased membrane protein thiol group content in brain mitochondria, indicating that this compound acts directly on MPT pore containing thiol groups. Taken together, it may be presumed that the mitochondrial energy and redox homeostasis impairment caused by sulfite and thiosulfate and MPT induced by sulfite may be involved in the neurological dysfunction observed in patients affected by SO deficiency.

A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

O sulfito e o tiossulfato estão acumulados em tecidos e líquidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da sulfito oxidase (SO), uma enzima mitocondrial que catalisa a oxidação de sulfito derivado do metabolismo de aminoácidos sulfurados. A deficiência da SO é causada pela deficiência isolada da enzima SO ou por uma deficiência na rota de biossíntese de seu cofator molibdênio. Os indivíduos afetados por esta desordem apresentam disfunção neurológica progressiva, convulsões neonatais severas, subluxação do cristalino, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento, resultando geralmente em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico encontrado em pacientes deficientes para a SO ainda não está esclarecida, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre parâmetros de metabolismo energético e homeostase redox e mitocondrial em cérebro de ratos jovens. Inicialmente, verificamos que o sulfito inibe a atividade do complexo IV da cadeia respiratória, indicando que este composto prejudica o fluxo de elétrons, enquanto que o tiossulfato não afetou a atividade de nenhum dos complexos da cadeia respiratória em sobrenadantes de córtex cerebral. Também foi verificado que o sulfito e o tiossulfato diminuem a atividade da creatina quinase total (tCK) e de suas isoformas mitocondrial e citosólica, sugerindo que estes compostos prejudicam o tamponamento e a transferência de energia celular no cérebro. Além disso, melatonina, trolox (análogo solúvel do α-tocoferol), glutationa e o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metil éster atenuaram ou preveniram totalmente a inibição da tCK induzida por sulfito e tiossulfato, sugerindo o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nestes efeitos. O sulfito e o tiossulfato também aumentaram a oxidação da 2’,7’-diclorofluorescina e inibiram a atividade da aconitase, enquanto que somente o sulfito aumentou a produção de peróxido de hidrogênio, reforçando o envolvimento de dano oxidativo nos efeitos provocados por estes metabólitos. Contudo, a atividade da enzima Na+,K+-ATPase sináptica não foi alterada pelo sulfito e tiossulfato. Em seguida, observamos que o sulfito dissipa o potencial de membrana mitocondrial na presença de Ca2+, de forma dose-dependente de sulfito e Ca2+ em preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O sulfito também induziu inchamento e diminuiu a capacidade de retenção de Ca2+, os níveis de NAD(P)H na matriz e o imunoconteúdo de citocromo c em mitocôndrias quando Ca2+ estava presente no meio. Além disso, as alterações provocadas pelo sulfito foram prevenidas por rutênio vermelho, ciclosporina A e ADP, sugerindo que o sulfito induz transição da permeabilidade mitocondrial (MPT). Também foi verificado que dentre vários inibidores da MPT, incluindo antioxidantes, inibidores da fosfolipase A2 e o regente redutor ditiotreitol, apenas o agente alquilante de tióis N-etilmaleimida foi capaz de prevenir o inchamento mitocondrial causado por sulfito. O sulfito também diminuiu o conteúdo de grupamentos tiol de proteínas de membrana em preparações mitocondriais de cérebro, indicando que este composto age diretamente sobre grupamentos tiol contidos no poro de MPT. Assim, pode-se presumir que o prejuízo no metabolismo energético e na homeostase redox causados pelo sulfito e pelo tiossulfato e que a indução de MPT pelo sulfito podem estar envolvidos na disfunção neurológica observada nos portadores da deficiência da SO. / Sulfite and thiosulfate accumulate in tissues and biological fluids of patients affected by the deficiency of sulfite oxidase (SO), which is a mitochondrial enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite derived from the metabolism of sulfur amino acids. SO deficiency is caused by the isolated deficiency of the enzyme SO itself or by a deficiency in the biosynthetic pathway of its molybdenum cofactor. Individuals affected by this disorder present progressive neurological dysfunction, severe neonatal seizures, lens subluxation, axial hypotonia, limb hypertonicity and failure to thrive, resulting often in early childhood death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage found in SO deficient patients has not been totally established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of sulfite and thiosulfate on parameters of energy metabolism, as well as redox and mitochondrial homeostasis in rat brain. First, we verified that sulfite inhibited the activity of complex IV of the respiratory chain in cerebral cortex supernatants, indicating that this compound impairs the electron transfer flow, whereas thiosulfate did not affect any of the activities of the respiratory chain complexes. It was also found that sulfite and thiosulfate markedly decreased the activity of total creatine kinase (tCK) and its mitochondrial and cytosolic isoforms, suggesting that these compounds impair brain cellular energy buffering and transfer. Moreover, melatonin, trolox (soluble analogue of α-tocopherol), glutathione and the nitric oxide synthase inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester attenuated or fully prevented the inhibition of tCK induced by sulfite and thiosulfate, suggesting the involvement of reactive oxygen and nitrogen species in these effects. Sulfite and thiosulfate also increased 2’,7’-dichlorofluorescin oxidation and inhibited the activity of aconitase, whereas only sulfite increased hydrogen peroxide production, reinforcing the involvement of oxidative damage in the effects elicited by these metabolites. In contrast, synaptic Na+,K+-ATPase activity was not altered by sulfite and thiosulfate. Next, we observed that sulfite dissipates mitochondria membrane potential in the presence of Ca2+, in a sulfite and Ca2+ dose-dependent manner. Sulfite also induced swelling and decreased Ca2+ retention capacity, matrix NAD(P)H pool and cytochrome c immunocontent in mitochondria when Ca2+ was present in the medium. Furthermore, the alterations elicited by sulfite were prevented by ruthenium red, cyclosporine A and ADP, supporting the involvement of mitochondrial permeability transition (MPT) in these effects. It was also verified that among various MPT inhibitors, including antioxidants, phospholipase A2 inhibitors and the reductant reagent dithiothreitol, only the thiol alkylating agent N-ethylmaleimide was able to prevent the sulfite-elicited mitochondrial swelling. Moreover, sulfite decreased membrane protein thiol group content in brain mitochondria, indicating that this compound acts directly on MPT pore containing thiol groups. Taken together, it may be presumed that the mitochondrial energy and redox homeostasis impairment caused by sulfite and thiosulfate and MPT induced by sulfite may be involved in the neurological dysfunction observed in patients affected by SO deficiency.

O sulfito e o tiossulfato encontram-se acumulados na deficiência da sulfito oxidase (SO), ao passo que o tiossulfato também se acumula na deficiência da proteína da encefalopatia etilmalônica 1 (ETHE1). Os pacientes apresentam principalmente encefalopatia progressiva e convulsões neonatais graves, resultando geralmente em morte prematura. Neste estudo, investigamos os efeitos in vivo do sulfito em estruturas encefálicas de ratos com deficiência da SO, e da administração intraestriatal de sulfito e tiossulfato em ratos normais sobre a homeostase redox e mitocondrial. Também avaliamos alterações nesses parâmetros em fibroblastos de pacientes. Inicialmente, observamos que o sulfito diminuiu os níveis de GSH e as atividades da glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral, e da GST no cerebelo de animais deficientes para a SO. Além disso, o sulfito aumentou as atividades dos complexos II e II-III em estriado e do complexo II no hipocampo, mas diminuiu a atividade do complexo IV no estriado de animais com deficiência da SO. Nesses animais, o sulfito também reduziu o potencial de membrana mitocondrial no córtex cerebral e no estriado, além de diminuir as atividades da malato e glutamato desidrogenase. Já nos animais que receberam injeção intraestriatal de sulfito ou tiossulfato, ambos os compostos diminuíram as atividades da creatina cinase e da citrato sintase, enquanto que o sulfito reduziu a massa mitocondrial. O sulfito ainda diminuiu os níveis de GSH e as atividades da glutationa peroxidase (GPx), GR, GST e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), enquanto que o sulfito e o tiossulfato aumentaram a atividade da catalase. O sulfito também diminui os níveis nucleares de PGC-1α e induziu reatividade glial e dano neuronal. As alterações causadas pelo sulfito foram prevenidas pelo tratamento com bezafibrato. Por fim, nos estudos realizados em fibroblastos, utilizamos células de quatro pacientes com deficiência da ETHE1 e de um paciente com deficiência da SO. Observamos diminuição da respiração mitocondrial em todos os tipos celulares, e diminuição de ATP em duas linhagens com deficiência da ETHE1 e na linhagem com deficiência da SO. Também verificamos alterações variáveis no conteúdo de proteínas de dinâmica mitocondrial, e uma diminuição do conteúdo de proteínas envolvidas na comunicação entre retículo endoplasmático (RE) e mitocôndria. Um aumento nos níveis de DDIT3, marcadora de estresse de RE, na produção de superóxido e apoptose também foram verificados em todos os tipos celulares. O tratamento com JP4-039, um antioxidante mitocondrial, diminuiu os níveis de superóxido em todas as linhagens celulares e aumentou a respiração mitocondrial em duas linhagens com deficiência da ETHE1 e na linhagem com deficiência da SO. Os achados deste trabalho evidenciam que alterações na homeostase energética e redox, na biogênese e dinâmica mitocondrial, bem como na comunicação entre mitocôndria e RE são mecanismos patológicos envolvidos nas deficiências da SO e da ETHE1. Além disso, visto que o bezafibrato e o JP4-039 exerceram efeitos protetores nos diferentes modelos, pode ser sugerido que esses compostos são promissores para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para as deficiências da SO e da ETHE1. / Sulfite and thiosulfate are accumulated in tissues of patients affected by sulfite oxidase (SO) deficiency, whereas thiosulfate also accumulates in the deficiency of ethylmalonic encephalopathy protein 1 (ETHE1). Patients present progressive encephalopathy and severe neonatal seizures, often resulting in early childhood death. In this study, we investigated the effects of sulfite in encephalic structures of SO-deficient rats, and of an intrastriatal injection of sulfite or thiosulfate in normal rats on redox and mitochondrial homeostasis. We also investigated possible alterations in these parameters in fibroblasts of patients. Initially, we observed that sulfite decreased reduced glutathione (GSH) levels and the activities of glutathione reductase (GR) and glutathione S-transferase (GST) in cerebral cortex, and of GST in cerebellum of SO deficient rats. Moreover, sulfite increased the activities of the respiratory chain complexes II and II-III in striatum and of complex II in hippocampus, whereas complex IV activity was decreased in striatum of SO deficient animals. In these animals, sulfite also reduced mitochondrial membrane potential in the cerebral cortex and in the striatum, as well as inhibited the activities of malate and glutamate dehydrogenase in cerebral cortex. Regarding the rats that received sulfite or thiosulfate via intrastriatal injection, both compounds reduced creatine kinase and citrate synthase activities, while sulfite decreased mitochondrial mass. Sulfite also decreased GSH levels and the activities of glutathione peroxidase (GPx), GR, GST, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), whereas both sulfite and thiosulfate increased catalase activity. In addition, sulfite decreased PGC-1α nuclear levels and induced glial reactivity and neuronal damage. Bezafibrate prevented the alterations induced by sulfite in striatum. Finally, in the experiments with fibroblasts, we used four cell lines with ETHE1 deficiency and one cell line with SO deficiency. We observed a decrease in basal and maximal respiration in all cell lines, and ATP depletion in two ETHE1 deficient cell lines and in the SO deficient fibroblasts. We also verified variable alterations in the content of proteins involved in mitochondrial dynamics, and a decrease in the content of proteins involved in endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria communication. Increased content of DDIT3, an ER stress marker, as well as high levels of superoxide and apoptosis induction were further seen in all cell lines. Treatment with the mitochondria-targeted free radical scavenger JP4-039 decreased superoxide levels in all cells lines and increased basal and maximal respiration in two ETHE1 deficient cell lines and in the SO deficient cells. Our findings provide evidence that alterations in energy and redox homeostasis, mitochondrial biogenesis and dynamics, as well as in the communication between mitochondria and ER are pathological mechanisms involved in the SO and ETHE1 deficiencies. Furthermore, since bezafibrate and JP4-039 exerted protective effects, it may be suggested that these compounds are attractive agents for the development of new therapeutic strategies aiming to improve the prognosis of patients affected by SO and ETHE1 deficiency.

O sulfito e o tiossulfato encontram-se acumulados na deficiência da sulfito oxidase (SO), ao passo que o tiossulfato também se acumula na deficiência da proteína da encefalopatia etilmalônica 1 (ETHE1). Os pacientes apresentam principalmente encefalopatia progressiva e convulsões neonatais graves, resultando geralmente em morte prematura. Neste estudo, investigamos os efeitos in vivo do sulfito em estruturas encefálicas de ratos com deficiência da SO, e da administração intraestriatal de sulfito e tiossulfato em ratos normais sobre a homeostase redox e mitocondrial. Também avaliamos alterações nesses parâmetros em fibroblastos de pacientes. Inicialmente, observamos que o sulfito diminuiu os níveis de GSH e as atividades da glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral, e da GST no cerebelo de animais deficientes para a SO. Além disso, o sulfito aumentou as atividades dos complexos II e II-III em estriado e do complexo II no hipocampo, mas diminuiu a atividade do complexo IV no estriado de animais com deficiência da SO. Nesses animais, o sulfito também reduziu o potencial de membrana mitocondrial no córtex cerebral e no estriado, além de diminuir as atividades da malato e glutamato desidrogenase. Já nos animais que receberam injeção intraestriatal de sulfito ou tiossulfato, ambos os compostos diminuíram as atividades da creatina cinase e da citrato sintase, enquanto que o sulfito reduziu a massa mitocondrial. O sulfito ainda diminuiu os níveis de GSH e as atividades da glutationa peroxidase (GPx), GR, GST e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), enquanto que o sulfito e o tiossulfato aumentaram a atividade da catalase. O sulfito também diminui os níveis nucleares de PGC-1α e induziu reatividade glial e dano neuronal. As alterações causadas pelo sulfito foram prevenidas pelo tratamento com bezafibrato. Por fim, nos estudos realizados em fibroblastos, utilizamos células de quatro pacientes com deficiência da ETHE1 e de um paciente com deficiência da SO. Observamos diminuição da respiração mitocondrial em todos os tipos celulares, e diminuição de ATP em duas linhagens com deficiência da ETHE1 e na linhagem com deficiência da SO. Também verificamos alterações variáveis no conteúdo de proteínas de dinâmica mitocondrial, e uma diminuição do conteúdo de proteínas envolvidas na comunicação entre retículo endoplasmático (RE) e mitocôndria. Um aumento nos níveis de DDIT3, marcadora de estresse de RE, na produção de superóxido e apoptose também foram verificados em todos os tipos celulares. O tratamento com JP4-039, um antioxidante mitocondrial, diminuiu os níveis de superóxido em todas as linhagens celulares e aumentou a respiração mitocondrial em duas linhagens com deficiência da ETHE1 e na linhagem com deficiência da SO. Os achados deste trabalho evidenciam que alterações na homeostase energética e redox, na biogênese e dinâmica mitocondrial, bem como na comunicação entre mitocôndria e RE são mecanismos patológicos envolvidos nas deficiências da SO e da ETHE1. Além disso, visto que o bezafibrato e o JP4-039 exerceram efeitos protetores nos diferentes modelos, pode ser sugerido que esses compostos são promissores para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para as deficiências da SO e da ETHE1. / Sulfite and thiosulfate are accumulated in tissues of patients affected by sulfite oxidase (SO) deficiency, whereas thiosulfate also accumulates in the deficiency of ethylmalonic encephalopathy protein 1 (ETHE1). Patients present progressive encephalopathy and severe neonatal seizures, often resulting in early childhood death. In this study, we investigated the effects of sulfite in encephalic structures of SO-deficient rats, and of an intrastriatal injection of sulfite or thiosulfate in normal rats on redox and mitochondrial homeostasis. We also investigated possible alterations in these parameters in fibroblasts of patients. Initially, we observed that sulfite decreased reduced glutathione (GSH) levels and the activities of glutathione reductase (GR) and glutathione S-transferase (GST) in cerebral cortex, and of GST in cerebellum of SO deficient rats. Moreover, sulfite increased the activities of the respiratory chain complexes II and II-III in striatum and of complex II in hippocampus, whereas complex IV activity was decreased in striatum of SO deficient animals. In these animals, sulfite also reduced mitochondrial membrane potential in the cerebral cortex and in the striatum, as well as inhibited the activities of malate and glutamate dehydrogenase in cerebral cortex. Regarding the rats that received sulfite or thiosulfate via intrastriatal injection, both compounds reduced creatine kinase and citrate synthase activities, while sulfite decreased mitochondrial mass. Sulfite also decreased GSH levels and the activities of glutathione peroxidase (GPx), GR, GST, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), whereas both sulfite and thiosulfate increased catalase activity. In addition, sulfite decreased PGC-1α nuclear levels and induced glial reactivity and neuronal damage. Bezafibrate prevented the alterations induced by sulfite in striatum. Finally, in the experiments with fibroblasts, we used four cell lines with ETHE1 deficiency and one cell line with SO deficiency. We observed a decrease in basal and maximal respiration in all cell lines, and ATP depletion in two ETHE1 deficient cell lines and in the SO deficient fibroblasts. We also verified variable alterations in the content of proteins involved in mitochondrial dynamics, and a decrease in the content of proteins involved in endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria communication. Increased content of DDIT3, an ER stress marker, as well as high levels of superoxide and apoptosis induction were further seen in all cell lines. Treatment with the mitochondria-targeted free radical scavenger JP4-039 decreased superoxide levels in all cells lines and increased basal and maximal respiration in two ETHE1 deficient cell lines and in the SO deficient cells. Our findings provide evidence that alterations in energy and redox homeostasis, mitochondrial biogenesis and dynamics, as well as in the communication between mitochondria and ER are pathological mechanisms involved in the SO and ETHE1 deficiencies. Furthermore, since bezafibrate and JP4-039 exerted protective effects, it may be suggested that these compounds are attractive agents for the development of new therapeutic strategies aiming to improve the prognosis of patients affected by SO and ETHE1 deficiency.

O sulfito e o tiossulfato encontram-se acumulados na deficiência da sulfito oxidase (SO), ao passo que o tiossulfato também se acumula na deficiência da proteína da encefalopatia etilmalônica 1 (ETHE1). Os pacientes apresentam principalmente encefalopatia progressiva e convulsões neonatais graves, resultando geralmente em morte prematura. Neste estudo, investigamos os efeitos in vivo do sulfito em estruturas encefálicas de ratos com deficiência da SO, e da administração intraestriatal de sulfito e tiossulfato em ratos normais sobre a homeostase redox e mitocondrial. Também avaliamos alterações nesses parâmetros em fibroblastos de pacientes. Inicialmente, observamos que o sulfito diminuiu os níveis de GSH e as atividades da glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral, e da GST no cerebelo de animais deficientes para a SO. Além disso, o sulfito aumentou as atividades dos complexos II e II-III em estriado e do complexo II no hipocampo, mas diminuiu a atividade do complexo IV no estriado de animais com deficiência da SO. Nesses animais, o sulfito também reduziu o potencial de membrana mitocondrial no córtex cerebral e no estriado, além de diminuir as atividades da malato e glutamato desidrogenase. Já nos animais que receberam injeção intraestriatal de sulfito ou tiossulfato, ambos os compostos diminuíram as atividades da creatina cinase e da citrato sintase, enquanto que o sulfito reduziu a massa mitocondrial. O sulfito ainda diminuiu os níveis de GSH e as atividades da glutationa peroxidase (GPx), GR, GST e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), enquanto que o sulfito e o tiossulfato aumentaram a atividade da catalase. O sulfito também diminui os níveis nucleares de PGC-1α e induziu reatividade glial e dano neuronal. As alterações causadas pelo sulfito foram prevenidas pelo tratamento com bezafibrato. Por fim, nos estudos realizados em fibroblastos, utilizamos células de quatro pacientes com deficiência da ETHE1 e de um paciente com deficiência da SO. Observamos diminuição da respiração mitocondrial em todos os tipos celulares, e diminuição de ATP em duas linhagens com deficiência da ETHE1 e na linhagem com deficiência da SO. Também verificamos alterações variáveis no conteúdo de proteínas de dinâmica mitocondrial, e uma diminuição do conteúdo de proteínas envolvidas na comunicação entre retículo endoplasmático (RE) e mitocôndria. Um aumento nos níveis de DDIT3, marcadora de estresse de RE, na produção de superóxido e apoptose também foram verificados em todos os tipos celulares. O tratamento com JP4-039, um antioxidante mitocondrial, diminuiu os níveis de superóxido em todas as linhagens celulares e aumentou a respiração mitocondrial em duas linhagens com deficiência da ETHE1 e na linhagem com deficiência da SO. Os achados deste trabalho evidenciam que alterações na homeostase energética e redox, na biogênese e dinâmica mitocondrial, bem como na comunicação entre mitocôndria e RE são mecanismos patológicos envolvidos nas deficiências da SO e da ETHE1. Além disso, visto que o bezafibrato e o JP4-039 exerceram efeitos protetores nos diferentes modelos, pode ser sugerido que esses compostos são promissores para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para as deficiências da SO e da ETHE1. / Sulfite and thiosulfate are accumulated in tissues of patients affected by sulfite oxidase (SO) deficiency, whereas thiosulfate also accumulates in the deficiency of ethylmalonic encephalopathy protein 1 (ETHE1). Patients present progressive encephalopathy and severe neonatal seizures, often resulting in early childhood death. In this study, we investigated the effects of sulfite in encephalic structures of SO-deficient rats, and of an intrastriatal injection of sulfite or thiosulfate in normal rats on redox and mitochondrial homeostasis. We also investigated possible alterations in these parameters in fibroblasts of patients. Initially, we observed that sulfite decreased reduced glutathione (GSH) levels and the activities of glutathione reductase (GR) and glutathione S-transferase (GST) in cerebral cortex, and of GST in cerebellum of SO deficient rats. Moreover, sulfite increased the activities of the respiratory chain complexes II and II-III in striatum and of complex II in hippocampus, whereas complex IV activity was decreased in striatum of SO deficient animals. In these animals, sulfite also reduced mitochondrial membrane potential in the cerebral cortex and in the striatum, as well as inhibited the activities of malate and glutamate dehydrogenase in cerebral cortex. Regarding the rats that received sulfite or thiosulfate via intrastriatal injection, both compounds reduced creatine kinase and citrate synthase activities, while sulfite decreased mitochondrial mass. Sulfite also decreased GSH levels and the activities of glutathione peroxidase (GPx), GR, GST, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), whereas both sulfite and thiosulfate increased catalase activity. In addition, sulfite decreased PGC-1α nuclear levels and induced glial reactivity and neuronal damage. Bezafibrate prevented the alterations induced by sulfite in striatum. Finally, in the experiments with fibroblasts, we used four cell lines with ETHE1 deficiency and one cell line with SO deficiency. We observed a decrease in basal and maximal respiration in all cell lines, and ATP depletion in two ETHE1 deficient cell lines and in the SO deficient fibroblasts. We also verified variable alterations in the content of proteins involved in mitochondrial dynamics, and a decrease in the content of proteins involved in endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria communication. Increased content of DDIT3, an ER stress marker, as well as high levels of superoxide and apoptosis induction were further seen in all cell lines. Treatment with the mitochondria-targeted free radical scavenger JP4-039 decreased superoxide levels in all cells lines and increased basal and maximal respiration in two ETHE1 deficient cell lines and in the SO deficient cells. Our findings provide evidence that alterations in energy and redox homeostasis, mitochondrial biogenesis and dynamics, as well as in the communication between mitochondria and ER are pathological mechanisms involved in the SO and ETHE1 deficiencies. Furthermore, since bezafibrate and JP4-039 exerted protective effects, it may be suggested that these compounds are attractive agents for the development of new therapeutic strategies aiming to improve the prognosis of patients affected by SO and ETHE1 deficiency.