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Topoisomerase 1-dependent Mutagenesis in Saccharomyces cerevisiaeCho, Jang-Eun January 2015 (has links)
<p>Topoisomerase 1 (Top1) resolves transcription-associated supercoils by generating transient single-strand breaks in DNA and is a major source of transcription-associated mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae. Top1 generates a distinctive mutation signature characterized by deletions in short, tandem repeats, and a similar signature is associated with ribonucleoside monophosphates (rNMPs) in DNA. DNA polymerases incorporate rNMPs into genomic DNA, and such rNMPs are efficiently removed in an error-free manner by ribonuclease (RNase) H2. In the absence of RNase H2, persistent rNMPs give rise to short deletions via a mutagenic process initiated by a Top1 incision at an rNMP. There is only partial overlap, however, between Top1-dependent deletion hotspots identified in highly transcribed DNA and those associated with rNMPs, suggesting the existence of both rNMP-dependent and rNMP-independent events. Here I present evidence that rNMP-independent hotspots reflect processing of a trapped Top1 cleavage complex (Top1cc), and that rNMP-dependent hotspots reflect sequential Top1 reactions. A sequential-cleavage model for rNMP-dependent deletions is tested in vivo and in vitro, employing Top1 cleavage and ligation assays. In addition, I report that rNMP-dependent hotspot activity is significantly enhanced when Top1 incises the non-transcribed strand of an actively transcribing reporter gene. Finally, I describe a novel type of mutagenesis that reflects repair of multiple Top1ccs. Specifically, expression of a mutant Top1 with reduced ligation activity (Top1-T722A) caused large deletion mutations that are distinct from Top1-dependent short deletions. Genetic data indicates that Top1-T722A-dependent large deletions are non-homologous end joining events.</p> / Dissertation
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Impact de l'haploinsuffisance d'ATR/CHK1 et de la Topoisomérase 1 sur la réplication et les Sites Fragiles Communs. / Impact of ATR/CHK1 haploinsufficiencies and Topoisomerase 1 on replication and Common Fragile Sites induction.Lemaçon, Delphine 27 June 2014 (has links)
Les Sites Fragiles Communs (SFCs) sont des points de cassures chromosomiques récurrents survenant suite à un stress réplicatif. La majorité d'entre eux ont été identifiés suite à un traitement à l'Aphidicoline (APC), un inhibiteur des ADN polymérases, ce qui explique pourquoi l'étude de leur fragilité est majoritairement basée sur des perturbations de la réplication. Parmi les facteurs impliqués dans la fragilité, ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 Related), une kinase engagée dans la signalisation des fourches de réplication bloquées, et sa cible CHK1 (Checkpoint Kinase 1), induisent l'apparition de cassures aux SFCs lorsqu'ils sont déplétés dans la cellule. Cependant, ces gènes sont difficiles à étudier car leur déplétion totale est létale pour les cellules. Nous avons donc choisi de développer un modèle basé sur l'utilisation de la lignée MSI de cancer colorectal HCT116de laquelle nous avons isolé des clones haploinsuffisants pour ATR ou CHK1.Ces mutations sont naturelles et sont d'ailleurs dans les cancers MSI. Aujourd'hui, de nouvelles données montrent que la transcription semble aussi être impliquée dans l'induction de certains SFCs. Pour étudier ce mécanisme, nous nous sommes servis de cellules déficientes pour la Topoisomérase 1 (Topo1) grâce à un shARN inductible. Cette protéine est impliquée dans la gestion des interférences entre les machineries de réplication et de transcription et son inhibition est à l'origine d'une forte instabilité chromosomique.Nos études démontrent tout d'abord que l'haploinsuffisance d'ATR ou de CHK1 retrouvée dans les cancers MSI génère des défauts de réplication, des problèmes de checkpoints ainsi que des cassures ADN et en particulier au niveau des SFCs. Une déficience en Topo1 induit aussi l'apparition de problèmes de réplication et une plus grande fragilité ADN, mais elle est aussi capable d'induire des cassures au niveau de certains SFCs, connus pour être sensible à des défauts de réplication. Une étude plus approfondie du SFC le plus fréquemment induit, FRA3B, montre qu'il est sensible à la fois à des défauts dans la voie ATR/CHK1, au stress réplicatif induits par l'aphidicoline mais aussi à la déficience en Topo1. Nos travaux suggèrent que l'haploinsuffisance d'ATR et CHK1 peut favoriser la cancérogenèse à travers l'induction des SFCs et que tous les SFCs n'ont pas les mêmes mécanismes d'induction, laissant la porte ouverte pour l’identification de nouveaux SFCs. / Common Fragile Sites (CFSs) are recurrent chromosomal breakpoints occurring when cells are exposed to replicative stress. Most CFSs have been identified following Aphidicolin (APC) treatment, an inhibitor of DNA polymerase and therefore the working model to explain their fragility is indeed mainly based on perturbation of replication. Among the key actors involved in fragility, ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3 Related), a kinase involved in stalled replication fork signaling, and its target CHK1 (Checkpoint Kinase 1), lead to enhanced chromosome fragility when transiently depleted in cells. However, ATR and CHK1 are difficult to study since their complete depletion is lethal for the cells. We have developed a colorectal cancer HCT116 MSI model harboring ATR or CHK1 haploinsufficient mutations found in MSI cancers. Transcription also seems to be involved in the induction of SFCs. To investigate this mechanism, we created topoisomerase 1 (Topo1) deficient cells with inducible shRNA. This protein is involved in interference between replication and transcription and its inhibition is associated with high chromosomal instability. Our studies indicate that ATR or CHK1 haploinsufficiency found in MSI cancers causes replication and checkpoints defects and induces DNA break particularly at CFSs. Topo1 deficiency is responsible of replication defects and DNA fragility and it induces breaks at some CFSs already known to be sensitive to replication defects. Moreover, a precise study of the most induced CFSs, FRA3B, shows that it is sensitive to defects in ATR/CHK1 pathway, to replicative stress induced by aphidicolin but also to Topo1 deficiency. Our results suggest that ATR and CHK1 haploinsufficiency can promote carcinogenesis through the induction of CFSs. Futhermore, we suggest that all CFSs do not rely on the same induction mechanisms, letting us to postulate that new CFSs are still to be identified.
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Activation fibroblastique et nouvelles approches thérapeutiques dans la Sclérodermie systémique / Fibroblast activation and new therapeutic approaches in systemic sclerosisKavian, Niloufar 20 June 2012 (has links)
Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le déclenchement et le développement de la sclérodermie systémique (ScS). Nous avons mis au point un modèle murin où la maladie est déclenchée par divers types de stress oxydant, puis nous avons exploré les différentes voies d'activation des fibroblastes sous l'effet des formes réactives de l'oxygène, afin de déterminer d'éventuelles cibles thérapeutiques. Pour apprécier les effets d’un stress oxydant chronique, des solutions contenant différents oxydants ont été injectées dans la peau de souris BALB/c et BALB/c SCID. Les solutions contenant le radical hydroxyl OH° ou HOCl ont induit une maladie caractérisée, comme la ScS diffuse, par une fibrose cutanée et viscérale, et des auto-anticorps anti-ADN topoisomérase-1. Les sérums de ces souris contenaient de grandes quantités de dérivés oxydés des protéines et induisaient la prolifération des fibroblastes et la production de formes réactives de l’oxygène par les cellules endothéliales. Une fibrose pulmonaire de moindre importance était induite chez les souris BALB/c SCID. Grâce à ce nouveau modèle murin de SSc, nous avons démontré que le stress oxydant était directement responsable des anomalies observées dans les fibroblastes, les cellules endothéliales et le système immunitaire. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour analyser les voies d’activation fibroblastique dans la ScS. Dans les fibroblastes des souris exposées à HOCl, on observe une dérégulation des voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes, et des récepteurs au PDGF. On observe les mêmes dérégulations ex vivo dans les fibroblastes de patients atteints de SSc diffuse. Nous avons ainsi observé une amélioration clinique significative chez les souris sclérodermiques traitées avec un inhibiteur de l’activation de Notch, avec un agoniste des récepteurs aux cannabinoïdes, et avec des inhibiteurs de tyrosine-kinase ciblant le récepteur au PDGF. Puisque les fibroblastes sclérodermiques ont un phénotype activé et produisent de forts taux de formes réactives de l’oxygène, nous avons enfin mis à profit cette particularité pour induire l’apoptose sélective de ces cellules dans le derme des souris. Le trioxyde d’arsenic, molécule cytotoxique utilisée en thérapeutique humaine, augmente la production cellulaire de formes réactives de l’oxygène au-delà d’un seuil létal et induit ainsi l’apoptose des fibroblastes sclérodermiques. L’utilisation in vivo de cette molécule dans notre modèle murin prévient la fibrose cutanée et viscérale, et les anomalies endothéliales. Le trioxyde d’arsenic a un effet comparable dans le modèle murin de ScS associée à la réaction du greffon contre l’hôte en détruisant les lymphocytes T CD4+ alloréactifs activés et les cellules dendritiques plasmacytoïdes responsables de l’activation du système immunitaire. Les formes réactives de l’oxygène sont donc impliquées dans l’induction des lésions observées au cours de la ScS. Dans notre modèle, le rôle du système immunitaire intervient dans l'auto-entretien et l’extension systémique de la maladie. Le stress oxydant contribue à la dérégulation de diverses voies de signalisation dont les voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes et du PDGF dans les fibroblastes. La modulation de ces voies permet d’obtenir une amélioration clinique chez les souris sclérodermiques, tout comme l’utilisation du trioxyde d’arsenic qui entraîne la délétion spécifique des fibroblastes sclérodermiques surpoduisant des formes réactives de l’oxygène. Le trioxyde d’arsenic montre également une efficacité intéressante dans le modèle de sclérodermie associée à la maladie du greffon contre l’hôte via la délétion des lymphocytes T CD4+ alloréactifs. / We defend the thesis that the oxidative stress plays a major role in the initiation and the development of systemic sclerosis. To demonstrate this thesis, we designed an original mouse model: BALB/c and BALB/SCID mice were injected intra-dermally with prooxidative agents, bleomycin or PBS for 6 weeks. Hypochlorite and hydroxyl radicals induced cutaneous and lung fibrosis in BALB/c mice, in association with anti-DNA topoisomerase-1 auto-antibodies that characterize human diffuse systemic sclerosis. Pulmonary fibrosis was less extensive in BALB/c SCID mice submitted to the same protocol. In this model of HOCl-induced systemic sclerosis, cutaneous fibroblasts display a hyperactivated phenotype that prompted us to investigate several pathways of cellular activation. The NOTCH pathway and the PGDF-receptor pathways were found upregulated in the skin of HOCl-mice. DAPT (a gamma secretase inhibitor that prevents NOTCH cleavage), Sunitinib (an inhibitor of PGDF-receptor phosphorylation), and WIN-55,212, an agonist of the cannabinoid receptors 1 and 2, dramatically improved the clinical, histological and biological signs of systemic sclerosis in the HOCl model.In our model as in patients with SSc, activated fibroblasts produce reactive oxygen species that exert an autocrine effect on their own proliferation and collagen synthesis. By analogy with tumor cells that undergo apoptosis upon cytotoxic treatment that triggers an oxidative stress beyond a lethal threshold, we showed that activated fibroblasts can be selectively killed by the cytotoxic molecule arsenic trioxide (As2O3) that generates intracellular ROS. In the mouse model of sclerodermatous-graft versus host disease (Scl-GVHD), daily intra-peritoneal injections of As2O3 abrogated the clinical symptoms (diarrhea, alopecia, vasculitis, fibrosis of the skin and visceral organs) and specifically induced the apoptosis of activated CD4+ T cells and plasmacytoid dendritic cells. Those data provide a rationale for the evaluation of As2O3 in the management of patients affected by systemic sclerosis or chronic GVHD.
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