Dans le champ des méthodologies dédiées à la caractérisation des microorganismes, les méthodes spectroscopiques comme la spectroscopie de fluorescence apparaisent des outils particulièrement sensibles. Leur puissance est renforcée par l'utilisation d'outils chimiométriques qui autorisent le traitement de l'ensemble des informations spectrales. Ce mémoire présente les étapes de mise au point de la méthode pour la caractérisation des Pseudomonads qui constituent une des flores les plus adaptatives et présentant la plus grande diversité phénotypique et génotypique décrite à ce jour. Par l'utilisation de fluorophores intrinsèques (NADH, Acides aminés aromatiques + Acides nucléiques ou tryptophane) l'analyse de suspensions bactériennes préparées directement à partir de colonies permet d'obtenir plus de 90% de bonne classification pour des souches de référence même réparties en taxons proches. Cette méthode a permis, également, une identification aisée d'isolats et les résultats obtenus sont apparus cohérents avec ceux issus de PCR tout en apportant des informations complémentaires à ceux obtenus par identification sur galerie API 20 NE. LA méthode a été développée pour une lecture directe des colonies sur un milieu gélosé. Après différentes étapes de cadrage, la meilleure pertinence a été obtenue pour une lecture des colonies en fluorescence synchrone avec un décalage constant de 30 nm. L'analyse de la variance a montré une excellente répétabilité des résultats mais aussi des effets" position de la fibre optique vis à vis de la colonie" et durée d'incubation avant lecture (entre 48 et 72 heures) négligeables. Utilisée à des fins taxonomiques, la méthode s'est révélée très cohérente et complémentaire des méthodes relevant de la génomique. Elle permet d'analyser extrêmement rapidement et sans ajout de réactifs les proximités ou distance entre souches et de décrire les zones spectrales les plus identitaires. Enfin, nous avons aussi montré les potentialités de la spectroscopie de fluorescence pour la mise en place d'un outil de "traçabilité bactérienne" susceptible de répondre aux besoins des producteurs agroalimentaires dans leur démarche d'analyse des risques.