Chez les vertébrés, la neurulation représente les premiers stades de développement du système nerveux durant l'embryogenèse. Elle consiste en la formation, à partir du neuroectoderme, des premières ébauches du système nerveux. Ce processus est finement régulé par un réseau complexe de gènes et le dérèglement de l'un d'entre eux peut entraîner le développement d'une maladie congénitale. Le traitement et la prévention de ces maladies passent par le savoir et la compréhension des différents processus impliqués dans le développement du système nerveux. La souris est un bon modèle d'étude in vivo de la neurogenèse et la technologie Cre-LoxP permet de contrôler l'activation spatiotemporelle d'un transgène. Cependant, aucun modèle de souris ne cible spécifiquement la plaque postérieure durant la neurulation de l'embryon. L'enhancer intronique Cdx2NSE a été caractérisé comme capable de récapituler l'expression du gène Cdx2 dans la plaque neurale postérieure. Notre nouvelle lignée de souris transgénique Cdx2NSE-Cre est capable d'exprimer la recombinase Cre dès le jour embryonnaire 7.5 (E.7.5) dans la plaque neurale postérieure. Elle permet ainsi de cibler le tube neural avec comme limite antérieure la partie caudale du rhomboncéphale. Dans ces mêmes limites, toutes les structures dérivées des cellules de la crête neurale vont également être ciblées par notre nouveau modèle murin, ce qui en fait un très bon outil pour l'étude de la neurogenèse. Le mécanisme de régulation des protéines Cdx spécifiquement dans le neuroectoderme est à ce jour toujours méconnu. L'étude in vitro de ce même enhancer Cdx2NSE nous a permis de montrer que les trois principales voies de signalisation impliquées dans le développement neural et dans l'induction des cellules de la crête neurale, à savoir les voies FGF, BMP et Wnt canonique, sont capables d'en réguler son expression sous le contrôle du gène rapporteur de la luciférase. Enfin, différentes études suggèrent une implication des protéines Cdx dans l'induction des cellules de la crête neurale et dans la fermeture du tube neural, notamment par la régulation de Pax3. Les enhancers de la crête neurale de Pax3 NCE1 et NCE2 sont effectivement régulés par la voie Wnt-Cdx (Sanchez-Ferras et al., 2012) mais un troisième enhancer de la crête neurale (NCE3) a été également caractérisé (Dagenhardt et al., 2010). Nos résultats préliminaires en essai luciférase nous suggèrent une régulation positive de cet enhancer NCE3 par les protéines Cdx1 et Cdx2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : neurogenèse, Cdx2NSE, souris, voies de signalisation, Cdx, Pax3, NCE3

Thesis (Ph.D. in Toxicology) -- University of Colorado, 2005. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 141-156). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Les bactéries ont besoin d’adapter leur cycle cellulaire et leur taux de croissance aux changements environnementaux et nutritionnels. L’initiation de la réplication est ainsi strictement coordonnée aux autres processus cellulaire afin de transmettre un chromosome conforme. Chez B. subtilis, bactérie modèle des Gram⁺, la protéine YabA joue un rôle majeur en réprimant l’initiation de la réplication, ceci en formant un complexe avec la protéine initiatrice DnaA et la clamp polymérase DnaN. YabA interagit en outre avec d’autres protéines partenaires et serait donc multifonctionnelle. Sa structure 3D révèle une architecture en deux domaines: Un domaine N-terminal adoptant un repliement de type superhélice et un domaine C-terminal globulaire structuré autour d’un atome de Zinc. In vivo, YabA est un tétramère par interaction entre les superhélices, connecté aux domaines C-terminaux monomériques par une séquence déstructurée hyper flexible. YabA serait un hub structural interagissant simultanément avec plusieurs protéines et constituerait une plate-forme d’intégration entre différents signaux intracellulaires et l’initiation de la réplication. La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité de nombreuses protéines en réponse à certains signaux cellulaires. Grâce à des expériences de phosphorylation in vitro et des analyses de spectrométrie de masse, nous avons montré que YabA est phosphorylée par la kinase de type Hanks YabT sur une thréonine, localisée dans la région flexible de liaison interdomaines. YabT est une kinase activée par l’ADN, exprimée en carence en glucose, en sporulation et en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants phosphomimétique de YabA (yabA-T71D) et non phosphorylable (yabA-T71A) pour i) confirmer le rôle de T71 dans la phosphorylation et ii) réaliser des études fonctionnelles.Nous avons montré in vivo que la phosphorylation de YabA n’est pas impliquée dans l’initiation de la réplication, mais module des programmes de différenciation. La phosphorylation de YabA module inversement la sporulation et la formation de biofilm, ce qui souligne sa multifonctionnalité et son implication dans la signalisation cellulaire connectant l’initiation de la réplication et la différenciation. Nos résultats suggèrent que la phosphorylation YabT-dépendante de YabA affecte la différenciation en modulant le taux intracellulaire de Spo0A-P. En effet, la phosphorylation de YabA est corrélée à un taux élevé de Spo0A-P, ce qui stimule la sporulation et inhibe la formation de biofilm. Par ailleurs, nos expériences de chromatographie sur couche fine (TLC) et de “In-Gel” suggèrent que YabA possède une activité “ATP/GTPasique” atypique modulée par la phosphorylation de YabA sur T71. Nos analyses fonctionnelles révèlent un rôle potentiel de YabA sur des voies de signalisation dépendant du c-di-GMP, qui contrôle la formation du biofilm chez de nombreuses bactéries. Ces résultats suggèrent que YabA joue un rôle complexe pendant la différenciation en intégrant différentes voies de signalisation. Enfin, des analyses de LC-MS montrent que lorsqu’elle est surexprimée chez Escherichia coli, YabA est phosphorylée sur la tyrosine 90, qui appartient au domaine d’interaction C-terminal. Une étude double-hybride chez la levure montre que la phosphorylation de Y90 module l’interaction de YabA avec ses partenaires DnaA et DnaN. In vivo, la phosphorylation de Y90 module l’initiation de la réplication. La kinase impliquée n’a pas encore été identifiée, mais ces résultats suggèrent l’existence d’un contrôle de l’initiation de la réplication lié à la phosphorylation de YabA chez B. subtilis. En conclusion, l’ensemble de nos études suggèrent l’existence de différents niveaux de régulation de l’activité de YabA par phosphorylation sur thréonine et tyrosine. YabA, outre son rôle dans l’initiation de la réplication, joue un rôle majeur dans la différenciation de B. subtilis. / Upon environmental or nutritional changes, bacteria must adjust their cell cycle with their growth rate. Most particularly, DNA replication initiation events must be controlled and coordinated with cell physiology to ensure faithful chromosome inheritance. In Bacillus subtilis, a model of Gram-positive bacteria, YabA plays a major role in down regulating initiation replication through interaction with the initiator protein DnaA and the clamp polymerase DnaN. However, YabA is a structural hub protein able to interact with other protein partners, indicating it might be multifunctional. Through its unique overall tri-dimentional structure composed of N-terminal four helix-bundle tetramer connected to four monomeric C-terminal domains by a highly flexible linker, YabA is capable to physically interact with more than one protein at a time, thus providing a suitable platform to integrate intracellular signals to replication initiation. Phosphorylation is the most prevalent post translational modification that modulates protein activities in response to cellular signals. Using in vitro phosphorylation and mass spectrometry we demonstrated that YabA is phosphorylated by the Hanks-type serine/threonine kinase YabT at a threonine residue localized within the flexible inter-domain region. YabT is a kinase activated by DNA and up-regulated during glucose starvation, sporulation and stationary phase. We constructed YabA phosphomimetic (yab-AT71D) and non-phosohorylatable (yabA-T71A) mutants to (i) confirm the requirement of T71 for YabT-mediated phosphorylation in vitro and (ii) perform in vivo and in vitro functional studies.We show in vivo that the phosphorylation of YabA is not involved in initiation control, but rather modulates bacillus developmental processes. We found that YabA phosphorylation inversely regulates sporulation and biofilm formation highlighting the multifunctional role of YabA as well as its role in integrating physiological signals to connect chromosomal replication initiation control with cell development. Our results support a role of YabT-mediated phosphorylation of YabA in Bacillus subtilis life-style decision making through the modulation of Spo0A-P intracellular levels. We established that YabA phosphorylation correlates with high cellular levels of Spo0A-P, leading to sporulation stimulation and preventing biofilm formation. Additionally, thin layer chromatography (TLC) analysis and In-Gel assays showed that YabA possess an atypical "ATP / GTPase" activity. This unusual activity seems to be modulated by phosphorylation of the YabA T71 residue. Our functional analysis pointed to a potential role of YabA in the c-di-GMP signaling transduction pathway, known to regulate biofilm formation in many bacteria. This suggesting a complex regulatory role of YabA during development, involving signaling crosstalk. LC-MS analyzes showed that when overexpressed in Escherichia coli, YabA is phosphorylated on the residue Y90 in a YabT independent manner. Y90 belongs to the interaction C-terminal domain, which contacts DnaA and DnaN. We found that Y90 was involved YabA-mediated replication initiation control. We provided evidence that phosphorylation state of YabA at Y90 can potentially modulates a protein-interaction switch with its protein partners DnaA and DnaN in a yeast-two-hybrid-based assay. Although we did not identified a kinase responsible for the phosphorylation of YabA at Y90 in B. subtilis, this finding hint at the possibility of a YabA-mediated control of initiation modulated by phosphorylation in this bacteria. Thus, all of these in vitro and in vivo observations suggest the existence of different modes of regulation of YabA activity by phosphorylation, involving threonine and tyrosine residues. This study established that YabA, apart from its role during replication initiation, plays a key regulatory role in B. subtilis development.

Hedgehog (Hh) est un morphogène secrété qui contrôle la croissance et la différentiation cellulaire chez les métazoaires. La dérégulation de son activité entraine des maladies développementales et de nombreux cancers chez l’adulte. Chez la drosophile, la transduction du signal Hh est initiée par la fixation de Hh sur son récepteur Patched (Ptc), conduisant à la stabilisation de la protéine membranaire Smoothened (Smo) et à l’activation du complexe de transduction composé de 5 protéines : les kinases Fused (Fu), PKA, GprK2, la kinésine Costal 2 (Cos2), et le facteur de transcription Cubitus Interruptus (Ci). Ma thèse a porté sur l’étude de la régulation et des interactions moléculaires entre les composants du complexe de transduction. Par des approches complémentaires, j’ai montré qu’en absence d’Hh, les protéines PKA et Fu interagissent du côté C-terminal de Ci, alors que la présence d’Hh induit leur relocalisation vers le domaine N-terminal de Ci. J’ai pu prouver que l’élément déclencheur de ce remaniement protéique est Smo. En présence d’Hh, Smo s’incorpore dans le complexe de transduction, conduisant à l’activation et au déplacement de Fu vers la région N-terminale de Ci. Ce remaniement entraine la phosphorylation et l’activation de Ci. Ma thèse révèle l’importance des changements de conformation au sein du complexe de transduction de la voie Hh. Le mécanisme de transduction étant conservé entre invertébrés et invertébrés, mon doctorat apporte des éléments de recherche pour mieux comprendre le fonctionnement normal et pathologique des cellules. / Hedgehog (Hh) is a secreted morphogen that controls growth and differentiation in both vertebrates and invertebrates. The dysregulation of its activity leads to severe developmental defects, and the onset of cancer in adults. In Drosophila, the Hh signal transduction is initiated by the binding of Hh to its receptor Patched (Ptc). This induces the stabilization of the transmembrane protein Smoothened (Smo) and the subsenquent activation of a transduction complex consisting of 5 proteins: the kinases Fused (Fu), PKA and Gprk2, the kinesin Costal2 (Cos2), and the transcription factor of the pathway Cubitus Interruptus (Ci). The aim of my thesis was to study the regulation and molecular interactions between the different components of the transduction complex. Thanks to complementary techniques, I have shown that in absence of Hh the proteins Fu and PKA interact in C-terminal part of Ci, whereas on the presence of Hh induces their relocalization toward the N-terminal domain of Ci. I have proved that the trigger element of this moving is Smo. In presence of Hh, Smo goes into transduction complex, allowing the activation and the moving of Fu toward N-terminal domain of Ci. This relocalization is responsible of Ci phosphorylation and activation. My thesis reveals the importance of conformational changes inside the transduction complex of Hh pathway. As the mechanism of transduction is conserved between species, my PhD provides research elements in order to better understand the normal and abnormal functioning of cells.

Les variations génétiques entre les individus peuvent expliquer plusieurs différences interindividuelles dans la présentation et la progression de certaines maladies. La parodontite apicale est une maladie causée par la réponse immunitaire de l'hôte en réponse à des pathogènes dans la pulpe dentaire. La reconnaissance decertains patrons moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) localisés sur les cellules pulpaires mène à l'activation de la voie de signalisation des récepteurs de type *Toll Like récepteur 4* (TLR4), menant à l'activation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB). Ceci se traduit en la production d'une multitude de médiateurs inflammatoires, comme l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-6 (IL-6) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Ces molécules jouent un rôle clé dans la pathogenèse de la parodontite apicale en altérant le mécanisme de remodelage osseux en faveur de la lyse osseuse. Le projet de recherche présenté vise à évaluer l'impact de certains polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) de la voie de signalisation des TLR4 sur la parodontite apicale. Les participants ont été recrutés dans les cliniques dentaires de la faculté de médecine dentaire de l'Université Laval. 52 participants avec une parodontite apicale ont été recrutés dans le groupe expérimental et 88 participants avec une santé bucco-dentaire optimale ont été recrutés pour le groupe contrôle. 3mL de salive de chaque participant ont été récoltés dans des tubes de collecte le jour de l'examen. Ces échantillons étaient ensuite utilisés pour en extraire l'ADN et effectuer un génotypage pour identifier les SNP visés par le projet de recherche. Deux SNPs du gène de TLR4 ont été sélectionnés (rs2770150 et rs4986790) ainsi que deux SNPs du gène de MYD88 (rs7744 et rs8177374). Une analyse statistique globale des participants ainsi que celles se basant sur l'âge et le sexe de deux groupes de participants ont été effectuées dans le but d'identifier une potentielle association entre ces SNPs de la voie de signalisation de TLR4 et la parodontite apicale. L'analyse statistique n'a révélé aucune association significative entre les génotypes et la prévalence de la parodontite apicale dans l'ensemble des données ou dans les analyses en sous-groupes. Selon les données disponibles dans ce projet de recherche, les SNPs rs2770150 et rs4986790 de TLR4 ainsi que rs7744 et rs8177374 de MYD88 n'ont pas d'impact sur la prévalence de laparodontite apicale ou la présence de symptômes cliniques dans la population québécoise.

La plupart des fonctions des epitheliums simples, tel que le transport vectoriel, l'absorption et la sécrétion, sont possibles grâce à la polarité épithéliale. La polarité épithéliale est caractérisée par la distribution asymétrique des composants cellulaires selon un axe apico-basal. L'altération de la polarité épithéliale est observée dans la plupart des cancers d'origine épithéliale. Lors de la polarisation épithéliale, la protéine CRB3 joue un rôle prépondérant. En effet, en absence de CRB3, les cellules épithéliales possèdent une polarité défectueuse et les jonctions cellulaires sont altérées, tel qu'observé lors de la tumorigénèse. De plus, l'augmentation de la prolifération, de même qu'une meilleure survie cellulaire sont également observés lors de la tumorigénèse. Selon notre hypothèse, la perte de la protéine de polarité CRB3, qui permet le maintien du domaine apical, serait capable de favoriser la prolifération et la survie cellulaire. Dans le but de vérifier notre hypothèse, nous avons d'abord généré des lignées cellulaires exprimant myc-CRB3 et un mutant de deletion de myc-CRB3, myc-CRB3[delta]ERLI, et nous avons testé par xénogreffes la tumorigénicité de ces celles-ci. Les résultats obtenus ont montrés la capacité de CRB3 à restreindre la croissance tumorale. Le taux de prolifération a été testé in vitro et a montré que CRB3 est capable de moduler à la baisse le taux de prolifération cellulaire. Pour mieux comprendre comment CRB3 est capable de moduler la prolifération, les voie Wnt, MAPK-ERK1/2 et PI(3)K-AKT, toutes trois connues pour leur rôle dans la prolifération cellulaire, ont été étudiées. Dans un premier temps, l'implication de la voie Wnt a été vérifiée par essais luciférases dans un contexte de surexpression de la protéine CRB3. Les résultats ont montrés que CRB3 est incapable de réprimer la voie Wnt. Dans un deuxième temps, l'activité de la voie MAPK-ERK1/2 a été testée par le niveau de phosphorylation de ERK1/2. CRB3 n'a pas eu d'effet sur cette voie. Finalement, l'activité de la voie PI(3)K-AKT a été testée par le degré de phosphorylation de AKT. Les résultats obtenus à partir d'extraits de tumeurs montrent que l'expression de CRB3 atténue grandement le niveau de phosphorylation de AKT. De plus, l'expression de CRB3 a permis de diminuer le taux de prolifération cellulaire et de sensibiliser les cellules à l'apoptose, deux fonctions cellulaires contrôlées par la voie PI(3)K-AKT. La modulation de cette voie par CRB3 a été confirmée par les résultats obtenus dans des tests de prolifération en présence de LY294002, un inhibiteur de la PI(3)K. Cet inhibiteur a permis de ramener le taux de prolifération de CRB3[Delta]ERLI, la forme dominante négative de CRB3, au niveau de la prolifération des cellules n'exprimant pas myc-CRB3 ou myc-CRB3[delta]ERLI.Dans l'ensemble, les résultats obtenus montrent le rôle potentiel de CRB3 dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaires via la voie PI(3)K-AKT. Ceci amène une compréhension supplémentaire du rôle des régulateurs de la polarité épithéliale dans la suppression de cancers.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Objectif: Plusieurs études écologiques, d'observation et expérimentales suggèrent que des apports ou des niveaux circulants élevés de vitamine D sont associés à des risques plus faibles de divers cancers, incluant le cancer du sein. Les effets de la vitamine D passent par son récepteur (VDR) et ultimement permettent la régulation de la croissance, de la différenciation, de l'apoptose et de plusieurs autres mécanismes cellulaires impliqués dans la carcinogenèse. Les variations génétiques (telles que les SNP pour « Single Nucleotide Polymorphisms ») des gènes qui codent pour les diverses protéines impliquées tout au long de la voie de signalisation de la vitamine D sont susceptibles d'influencer les effets de la vitamine D. Dans cette thèse seront examinés trois groupes d'associations : 1) les associations entre deux SNP du VDR et le risque de cancer du sein; 2) les associations entre plusieurs SNP situées tout au long de la voie de signalisation de la vitamine D et la densité mammaire à la mammographie, celle-ci étant un important marqueur intermédiaire du risque de cancer du sein; 3) les associations entre deux SNP du gène de la protéine de transport de la vitamine D (DBP) et la concentration circulante de vitamine D, le niveau circulant de 25-hydroxyvitamine D (25(OH)D) étant le meilleur marqueur du statut global en vitamine D. Méthodes : L'association entre deux SNP du VDR (Fokl et Bsml) et le risque de cancer du sein a été étudiée dans deux études cas-témoins indépendantes réalisées chez des femmes de la grande région de Québec (totalisant 937 cas et 1500 témoins ). Les associations entre 13 SNP de la voie de signalisation de la vitamine D et la densité mammaire ont été étudiées chez 741 femmes préménopausées ayant eu une mammographie de dépistage dans une clinique radiologique de Québec. Dans cette dernière population la relation entre deux SNP du gène de la protéine de transport de la vitamine D {DBP-1 et DBP-2) et le niveau sanguin de 25(OH)D a aussi été étudiée. Résultats : Les génotypes ff (homozygotes rares) du polymorphisme VDR Fokl sont associés à un risque de cancer du sein plus élevé (étude 1: RC=1,22, IC95%=0,76-1,95, étude 2: RC=1,44, IC95%= 1,05-1,99, études combinées: RC=1,33, IC95%= 1,03-1,73). Cette relation est modifiée par l'histoire familiale de cancer du sein dans les deux études tout comme dans leur analyse combinée (Pinteraction^O^l, 0,050, et 0,0059 respectivement). Les rapports de cotes parmi les femmes sans histoire familiale étaient de 1,00, 1,27 (IC95%=1,02-1,58) et 1,57 (IC95%=1,18-2,10) respectivement pour les porteuses de FF, Ff et ff (Ptendance=0,0013). Dans le cas du polymorphisme VDR Bsml, les génotypes Bb+bb étaient associés à une légère augmentation non significative du risque dans les deux études (RC combiné =1,22, IC95%=0,95-1,57) comparativement aux femmes avec le génotype BB, sans interaction avec l'histoire familiale. L'étude de l'association entre 13 polymorphismes situés sur les gènes vitamin D receptor (VDR), cytochrome P450, family 27, subfamily B, polypeptide 1 (CYP27B1) et vitamin Dbinding protein (DBP) n'a pas permis de détecter d'associations statistiquement significatives entre ces derniers et la densité mammaire (Ptendance>0,15) chez les femmes préménopausées. Les deux polymorphismes DBP-l et DBP-2 sont associés aux niveaux de 25(OH)D. Chaque copie additionnelle de l'allèle rare de DBP-l ou DBP-2 est associée à une baisse des niveaux de 25(OH)D (P=-3,29, Pte„dance=0,0003; p=-4,22, Ptendance=<,0001, respectivement). Ces associations semblent plus apparentes lorsqu'il y a beaucoup de vitamine D à transporter (P=-3,78 vs p=-l,74 pour DBP-l et B=-5,73 vs p=-3,03 pour DBP-2, respectivement en été/automne vs en hiver/printemps), l'effet modifiant n'étant cependant pas significatif (Pinteraction=0,27 et 0,16 respectivement). Enfin, ces deux SNP expliquent autant de variation des concentrations de 25(OH)D que les apports totaux en vitamine D (iM.3% pour DBP-l et r2 =2,0% pour DBP-2 vs r^l^/ o pour les apports en vitamine D). Conclusion : Dans leur ensemble les résultats présentés dans cette thèse supportent l'idée que la vitamine D et plusieurs polymorphismes de sa voie de signalisation sont susceptibles de jouer un rôle non négligeable dans l'étiologie du cancer du sein. On a en effet mis en évidence que les porteuses de certains polymorphismes du récepteur à la vitamine D sont plus à risque de cancer du sein. On a également démontré que des variations génétiques du gène de la protéine de transport de la vitamine D sont associées à un faible niveau sanguin de 25-hydroxyvitamine D (25(OH)D). Dans le contexte où les suppléments en vitamine D sont pressentis comme moyen pour réduire l'incidence du cancer du sein, ces résultats sont particulièrement importants puisqu'ils suggèrent que certains sous-groupes de la population pourraient bénéficier différemment d'un apport de cette vitamine. Cette hypothèse devrait faire l'objet de recherches ultérieures.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / La voie de signalisation Hedgehog est impliquée dans de nombreux processus nécessaires au bon développement et maintien des organes. Elle a lieu par fixation de ses ligands sur un récepteur qui se trouve soit à la surface membranaire des cellules, soit à la surface des cils. Les cils sont des extensions cellulaires, motiles ou non, se trouvant à la surface des cellules. Chez les mammifères, la voie de signalisation Hedgehog a principalement été identifiée à la surface des cils non motiles, appelés cils primaires. En leur sein, de nombreuses protéines, dont des récepteurs, se concentrent, permettant une amplification des différents signaux reçus. Cela permet aux cils primaires d'avoir une fonction d'antenne de signalisation, captant les signaux et les transmettant à la cellule. Bien que les cils primaires soient le lieu privilégié de la voie de signalisation Hedgehog, il a été montré que d'autres types de cils, des cils motiles, étaient également capables de la transduire. En cas de dysfonctionnement de cette voie de signalisation, ou bien des cils en eux-mêmes, plusieurs pathologies peuvent en découler, regroupées sous le nom de ciliopathies. Parmi la multitude de symptômes, des cas d'infertilité masculine sont décrits. Plusieurs études ont montré que cette voie de signalisation existe dans le système reproducteur mâle et femelle, tel dans l'épididyme ou l'endomètre. Dans cette étude, nous avons tenté d'élucider le rôle de la voie de signalisation Hedgehog dans le contrôle de la fertilité mâle de la maturation des spermatozoïdes. Nous avons tout d'abord étudié la voie Hedgehog au sein de l'épididyme. C'est l'organe en charge de la maturation des spermatozoïdes, ils y acquièrent une motilité primaire et d'autres modifications, nécessaires à la fertilité. Dans cet organe, les cellules susceptibles de répondre à la voie Hedgehog sont les cellules basales, car elles sont les seules cellules de l'épithélium à posséder un cil. La première partie de ce projet a été d'étudier le rôle in vitro de la voie de signalisation Hedgehog dans des cellules épididymaires immortalisées. Nous avons pu montrer grâce à ce modèle que la voie de signalisation Hedgehog dépendait bien de la présence du cil primaire. Après traitement pharmacologique, les cellules épithéliales répondent à la voie Hedgehog contrôlant ainsi l'expression de nombreux gènes, régulant la réponse immunitaire et la prolifération cellulaire. Nous avons dans un deuxième temps voulu comprendre in vivo le rôle de la voie Hedgehog, dépendante des cils primaires, dans les cellules basales de l'épididyme. Pour cela, nous avons créé un modèle murin présentant une délétion d'un facteur nécessaire à la voie Hedgehog spécifiquement dans les cellules basales, et comparé son phénotype à celui des souris contrôles. Nous avons pu montrer que la voie Hedgehog permettait de réguler l'homéostasie du tissu et plus particulièrement les propriétés des cellules basales. Ces dernières auraient de multiples fonctions dont le rôle de cellule souche épithéliale. Dans notre modèle, l'ablation d'une protéine ciliaire a empêché la régénération du tissu après dommages (ligation des canaux efférents). La voie Hedgehog pourrait donc être primordiale dans la réponse immunitaire après blessure ou inflammation, en régulant la prolifération cellulaire et la régénération tissulaire. Ces phénomènes pourraient donc avoir un lien indirect avec la maturation des spermatozoïdes dans l'épididyme, et donc dans le contrôle de la fertilité. Dans un troisième temps, nous avons voulu explorer pour la première fois le rôle direct de la voie Hedgehog sur les spermatozoïdes. En effet, ces cellules possèdent pareillement un cil : le flagelle. Nous avons donc posé l'hypothèse que les spermatozoïdes pourraient également être capable d'y répondre. En travaillant avec des spermatozoïdes de trois espèces mammifères différentes, nous avons pu montrer la présence des facteurs de la voie Hedgehog dans les spermatozoïdes. Les spermatozoïdes étaient également capables de répondre à cette voie, induisant un changement dans leur capacitation (motilité ; réaction acrosomique) et dans leur capacité à féconder un ovocyte. La voie Hedgehog pourrait donc avoir également un effet direct sur la maturation des spermatozoïdes. En conclusion, l'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension du contrôle de la fertilité mâle par la voie Hedgehog et ouvre la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / The Hedgehog signaling pathway is involved in many processes necessary for the proper development and maintenance of organs. Signalling takes place by binding of ligands to a receptor, which is either on the membrane surface of the cells, or on the surface of a cilium. Cilia are cellular extensions, motile or non-motile, found on the surface of cells. In mammals, the Hedgehog signaling pathway has primarily been identified on the surface of nonmotile cilia, called primary cilia. Within them, many proteins, including receptors, are concentrated, allowing amplification of the various signals received. This allows the primary cilia to act as a signalling antenna, picking up extracellular signals and transmitting them to the cell. Although the primary cilia are the main site of the Hedgehog signaling pathway, it has been shown that other types of cilia, motile cilia, are also able to transduce Hedgehog signalling. In case of dysfunctions of this signaling pathway, or of cilia themselves, several pathologies can result, grouped under the name of ciliopathies. Among the multitude of symptoms, cases of male infertility are described. Several studies have shown that this signaling pathway exists in the male and female reproductive system, such as in the epididymis or the endometrium. In this study, we attempted to elucidate the role of Hedgehog signaling pathway in male fertility and more specifically in the control of sperm maturation. We first studied the Hedgehog pathway within the epididymis. It is the organ in charge of the maturation of spermatozoa, there they acquire primary motility and other changes, necessary for fertility. In this organ, the cells likely to respond to the Hedgehog pathway are the basal cells, because they are the only cells of the epithelium to possess a cilia. The first part of this project was to study the in vitro role of the Hedgehog signaling pathway in immortalized epididymal cells. We were able to show, thanks to this in vitro model, that the Hedgehog signaling pathway did indeed depend on the presence of the primary cilium. After pharmacological treatment, the epithelial cells respond to the Hedgehog pathway thus controlling the expression of many genes, regulating the immune response and cell proliferation. Secondly, we wanted to better understand in vivo the role of the Hedgehog pathway, dependent on primary cilia, in the basal cells of the epididymis. For this, we created a mouse model presenting a deletion of a factor necessary for the Hedgehog pathway specifically in the basal cells and compared it with control mice. We have been able to show that the Hedgehog pathway regulates tissue homeostasis and more particularly the properties of basal cells in the epididymis. Basal cells have multiple functions including the role of epithelial stem cell. In our model, the ablation of a ciliary protein prevented tissue regeneration after efferent duct ligation. The Hedgehog pathway could therefore be essential in the immune response after injury or inflammation, by regulating cell proliferation and tissue regeneration. These phenomena could consequently have an indirect link with the maturation of spermatozoa in the epididymis, and thus in the control of male fertility. Thirdly, we wanted to explore for the first time the direct role of the Hedgehog pathway on spermatozoa. Indeed, these cells also have a cilium, the flagellum, and we therefore hypothesized that they could also be able to respond to it. By working with spermatozoa from three different mammalian species, we were able to show the presence of Hedgehog pathway factors in spermatozoa. Sperm cells were also able to respond to this pathway inducing a change in vitro in their capacitation (motility; acrosomal reaction) and in their ability to fertilize an oocyte. The Hedgehog pathway could therefore also have a direct impact on sperm maturation. In conclusion, this thesis research contributes to a better understanding of the control of male fertility by Hedgehog signalling and could open the way to the identification of new therapeutic targets.

Titre de l'écran-titre (visionné le 7 septembre 2023) / Les cellules épithéliales qui tapissent la lumière de l'épididyme travaillent de manière concertée afin d'établir un microenvironnement propice pour la maturation et le stockage des spermatozoïdes. Nous avons précédemment démontré que l'ATP, qui est sécrétée par les cellules principales de l'épididyme, fait partie d'un réseau de communication extracellulaire qui mène ultimement à la sécrétion de protons par les cellules claires avoisinantes. Le processus d'acidification luminale est nécessaire pour maintenir les spermatozoïdes dans un état de dormance pendant leur transit dans l'épididyme. Nos travaux visent à étudier la régulation autocrine des cellules principales, en identifiant les transporteurs impliqués dans le processus de sécrétion d'ATP ainsi que leur réponse à l'ATP extracellulaire. Nous avons observé une sécrétion d'ATP constitutive par la lignée de cellules principales épididymaires (DC2) qui était inhibée de façon significative par le Probénécide (PBN), un inhibiteur de la pannexine-1 (PANX-1), et par l'antagoniste de P2X7, A438079. Nous avons aussi confirmé que CFTR est un modulateur de la sécrétion d'ATP. De plus, lorsque les inhibiteurs étaient utilisés en combinaison (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN et CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), aucune inhibition additionnelle de la sécrétion basale d'ATP n'a été détectée, ce qui suggère que PANX-1, P2X7 et CFTR moduleraient un mécanisme commun de sécrétion d'ATP par les cellules DC2. Par ailleurs, l'ajout d'ATPɣS (analogue non-hydrolysable de l'ATP) a induit une augmentation significative des niveaux de calcium intracellulaire (Ca²⁺ᵢ), qui était réduite sans être complètement abolie en absence de calcium dans le milieu extracellulaire. Ces résultats suggèrent une régulation autocrine des cellules principales via l'activation de voies dépendantes du Ca²⁺ᵢ qui impliquerait à la fois les récepteurs P2X et P2Y. Nous procédons actuellement à l'identification des sous-types de récepteurs P2 responsables de l'augmentation du Ca²⁺ᵢ induit par l'ATP dans les cellules DC2. / Epithelial cells lining the epididymis work in a concerted manner to establish an optimal luminal environment for the maturation and storage of spermatozoa. We previously showed that ATP, secreted from principal cells (PCs), is part of a complex extracellular communication network that ultimately leads to activation of neighboring clear cells (CCs). In particular, ATP and its hydrolysis product adenosine stimulate proton secretion by CCs via apical accumulation of the proton pump V-ATPase. Luminal acidification maintains sperm in a quiescent state during their transit in the epididymis. Here we explored the autocrine regulation of PCs by dissecting the transporters involved in ATP secretion, as well as their response to extracellular ATP. Constitutive ATP secretion by the epididymal principal cell line (DC2) was observed, which was significantly inhibited by the pannexin-1 (PANX-1) inhibitor, probenecid (PBN), and the P2X7 antagonist A438079. We also confirmed that CFTR is a modulator of ATP secretion by using the CFTRᵢₙₕ₁₇₂. When inhibitors were applied together (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN, and CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), no additional inhibition was detected on basal levels of ATP release. Furthermore, our results showed that addition of ATPɣS (non-hydrolysable form of ATP) significantly increased intracellular calcium (Ca²⁺ᵢ) levels, indicating that PCs are regulated in an autocrine manner through ATP signaling. Our results also indicate the participation of both P2X receptors and P2Y receptors subtypes in this response to luminal ATP. Our study suggests that P2X7, PANX-1 and CFTR modulate a common ATP release mechanism in the epididymis, and that ATP participates in PCs autocrine regulation via activation of Ca²⁺⁻dependent pathways. We are currently examining the participation of P2 receptor subtypes in the ATP-induced Ca²⁺ᵢ increase.