Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290486.pdf: 1666475 bytes, checksum: bb23fc6e1b917c81adfeef1749eecfa9 (MD5) / O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente da parede de bactérias Gram-negativas capaz de induzir respostas inflamatórias sistêmicas pela capacidade de ativar o fator de transcrição nuclear .B (NF-.B). Além do LPS, a presença de citocinas como IFN-., também promovem a ativação do NF-.B. Uma vez que este fator é ativado, inúmeros genes pró-inflamatórios são transcritos, elevando a expressão de citocinas como TNF-a, IL-1, IL-6, IFN-. e a enzima NOS-2. Um dos mecanismos endógenos anti-inflamatórios mais importantes é a ativação de receptores de glicocorticoides (GR). Utilizando um modelo in vitro baseado em aspectos relevantes da sepse, uma doença de cunho inflamatório, mostrou-se que células musculares lisas (CML) de aorta de rato da linhagem A7r5 são ativadas pelo estímulo LPS/IFN produzindo NO, dosado na forma do seu metabólito, nitrito. De forma inédita, observou-se que a ativação das CML depende de um pulso inicial de NO oriundo de NOS constitutivas, uma vez que a inibição do mesmo diminui substancialmente a ativação celular. Além do pulso de NO, ocorre também uma rápida produção de EROs após estimulação das células com LPS. A caracterização e presença de GR funcionais nestas células permitiram o acompanhamento da sua dinâmica após estimulação com LPS/IFN. Surpreendentemente, a estimulação com LPS/IFN induz um aumento na translocação nuclear destes receptores de forma concomitante com a translocação nuclear do NF-.B, cuja intensidade de translocação é parcialmente regulada pelo NO. Outro fator que parece intermediar a translocação nuclear de GR e NF-.B e exercer um papel fundamental no curso da ativação celular é o peroxinitrito, que pode estar sendo formado imediatamente após a estimulação das células pela reação do pulso de NO com o ânion superóxido. Os resultados mostram que o NO e seus derivados desempenham um papel fundamental no início da ativação celular e na translocação nuclear de GR, contribuindo para o entendimento do início do processo de ativação celular.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.