Periodontal disease (PD) is a polymicrobial infection characterized by inflammation of the gingiva, alveolar bone resorption, and tooth loss (edentulism). Treponema denticola along with Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythia are among the “Red Complex” and are main etiological agents in PD. Treponemes are a member of the Spirochaeta phylum and are obligate anaerobes, that express pyruvate ferredoxin oxidoreductase (PFOR). The enzyme catalyzes the oxidation of pyruvate to acetyl-CoA and reduced ferredoxin. Amixicile is a novel bacteriostatic derivative of nitazoxanide and an inhibitor of PFOR. In light of the fact that Treponemes express PFOR, this study was conducted to investigate the susceptibility of oral Treponemes to AMX. All oral Treponemes tested were susceptible to AMX and the MIC values were determined ranging of 1.5-4.5 μg mL-1 for an initial starting cell concentration of 1.9x106 cells mL-1. Other potentially therapeutic effects for AMX for T. denticola were investigated: motility, hydrogen sulfide production, and serum sensitivity. AMX reduced overall spirochete motility by 50% at sub-MIC concentrations. There was a dose dependent decrease in H2S production in T. denticola at sub-MIC and MIC values. Furthermore, prior exposure of AMX led to increases in serum sensitivity. Taking into account the fact that other periodontal red complex bacteria express PFOR, AMX could serve as a new selective adjunctive treatment for periodontal disease.

Die angeborene Immunität ist in der Lage, Pathogene schon beim erstmaligen Eindringen zu erkennen und zu bekämpfen. Haupteffektoren der schnellen, angeborenen Immunantwort sind Makrophagen und polymorphkernige neutrophile Granulozyten. Diese erkennen und phagozytieren Pathogene und koordinieren die weitere Immunantwort durch die Freisetzung von inflammatorischen Mediatoren und Zytokinen. Die Erkennung mikrobieller Bestandteile, wie Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien bzw. Peptidoglykan (PG) und Lipoteichonsäuren (LTA) Gram-positiver Bakterien, führt zur Aktivierung von unterschiedlichen Proteinkinasen, des Transkriptionsfaktors NF-(B und zur Freisetzung von Zytokinen. Mitglieder der Toll-Proteinfamilie, sogenannte Toll-like-Rezeptoren (TLR), wurden kürzlich als Rezeptoren auf Immunzellen identifiziert, die für die Erkennung solcher mikrobieller Bestandteile verantwortlich sind. Während TLR-4 der LPS-Erkennung dient, und TLR-2 und -6 verschiedene Liganden von Gram-positiven Bakterien binden, blieb die Frage der Erkennung von LTA und verwandten Glykolipiden strittig. Sowohl TLR-2 als auch TLR-4 wurden für diese Rolle diskutiert. Zielsetzung dieser Arbeit war, die Rolle von TLRs in der LTA- und Glykolipid-Erkennung zu untersuchten. Glykolipide von zwei eng verwandten Treponemen-Spezies, T. maltophilum (TM) und T. brennaborense (TB), sowie neuartig aufgereinigte Lipoteichonsäuren von Staphylococcus aureus (SA) und Bacillus subtilis (BS) wurden eingesetzt, um die nukleäre Translokation von NF-(B in verschiedenen Zellsystemen zu induzieren. Diese Zellstimulationsexperimente wurden mit verschiedenen TLR-2-negativen Zellinien sowie mit Peritonealexsudatzellen TLR-4-defizienter C3H/HeJ-Mäuse durchgeführt. Weitere Informationen lieferten TLR-2-Überexpressions-Experimente sowie Zellstimulationen unter Verwendung von anti-TLR-4-Antikörpern. Die Aktivierung von NF-(B wurde anhand von Gelshifts nachgewiesen. Mit der Überexpression von dominant-negativen Mutanten verschiedener Moleküle der Signalkaskade, mit Kinase-Hemmstoffen und mit Western Blots wurden die intrazellulären Signaltransduktionswege untersucht. Für Glykolipide von T. maltophilum und beide verwendeten Lipoteichonsäuren ließ sich eine klare TLR-2-Abhängigkeit in der Aktivierung von NF-(B und der Induktion von proinflammatorischen Zytokinen zeigen. Die Glykolipide von T. brennaborense hingegen waren überraschender Weise gleichzeitig auch TLR-4-Liganden. Beide untersuchten Glykolipide sowie beide LTAs aktivierten einen Signalweg unter Einbeziehung des Adaptermoleküls MyD88 und der NF-(B-induzierenden Kinase (NIK). Des weiteren konnte der Einfluß der MAP-Kinasen p42/44 und p38 auf die Treponema-Glykolipid- und LPS-induzierte TNF-(-Ausschüttung dargestellt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß TLR-2 der Hauptrezeptor von Lipoteichonsäuren ist, und TLR-2 und -4 beide Rezeptoren der Treponema-Glykolipide sein können. Diese Ergebnisse sollten dazu beitragen, die molekularen Grundlagen der Reaktionen des Immunsystems auf Gram-positive Bakterien und Treponemen zu verstehen. / The innate immune response to microbial pathogens is able to protect the host after a first pathogen contact. This immediate immune response is largely mediated by macrophages and neutrophils. They recognize and phagocytose pathogens, and coordinate host responses by secreting inflammatory mediators, such as cytokines. The recognition of lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria, or peptidoglycan (PG) and lipoteichoic acids (LTAs) of Gram-positive bacteria leads to the induction of protein-kinases, the transcription factor NF-(B, and subsequently the release of proinflammatory cytokines. Recently, members of the Toll-protein-family, the so-called Toll-like receptors (TLRs) have been found to be involved in immune cell activation by microbial products. While TLR-4 has been identified as the transmembrane signal transducer for LPS, and TLR-2 and -6 for different ligands originating from Gram-positive bacteria, the molecular basis of recognition of lipoteichoic acids and related glycolipids has not been completely understood: Both, TLR-4 and -2 have been postulated as receptors. In order to determine the role of TLRs in immune cell activation by Treponema glycolipids and LTAs experiments involving TLR-2-negative cell lines, macrophages from TLR-4-deficient C3H/HeJ-mice, cells overexpression TLR-2, and inhibitory TLR-4 antibodies were performed. The induction of NF-(B was assessed by electrophoretic mobility shift assays. Glycolipids of two related Treponema species, T. maltophilum (TM) and T. brennaborense (TB), and LTAs from Staphylococcus aureus (SA) and Bacillus subtilis (BS) were investigated for induction of nuclear translocation of NF-(B in different cell systems. Glycolipids from T. maltophilum and both LTAs studied revealed TLR-2-dependency in induction of NF-(B and proinflammatory cytokines. Surprisingly, glycolipids from T. brennaborense were found to be TLR-4-ligands. Furthermore an involvement of the signaling molecules MyD88 and NIK in cell stimulation by LTAs and glycolipids was revealed by dominant-negative overexpression experiments. The induction of TNF-( by Treponema glycolipids furthermore was dependent on activation of MAP kinases p42/44 and p38, as indicated by specific kinase inhibitors. Tyrosinephosporylation of the p42/44 kinase induced by Treponema glycolipids were detected by western blots. In summary, the results presented here indicate that TLR-2 is the main receptor for LTAs. Both TLR-2 and -4 serve as receptors for Treponema glycolipids. These results may potentially contribute to explain immune responses to Gram-positive bacteria and treponemes.