Submitted by Israel Vieira Neto (israel.vieiraneto@ufpe.br) on 2015-03-05T19:28:07Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vicente de Paulo dos Anjos.pdf: 1268595 bytes, checksum: 1d1caae923b11bb4068e6694be7813fd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T19:28:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vicente de Paulo dos Anjos.pdf: 1268595 bytes, checksum: 1d1caae923b11bb4068e6694be7813fd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / FACEPE / Diversos imunoensaios vem sendo empregados na rotina laboratorial para dosagem das troponinas cardíacas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade no diagnóstico do infarto agudo do miocárdio. Entretanto, estes métodos apresentam significativas limitações para diagnóstico à beira do leito de pacientes infartados de modo prático, rápido e seguro. Dessa forma, os imunossensores eletroquímicos surgem como uma importante ferramenta analítica. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um imunossensor eletroquímico baseado em um filme nanoestruturado de pirrol-2-carboxílico e nanotubos de haloisita para detecção de níveis clínicos da troponina T cardíaca humana. O eletrodo de carbono vítreo foi submetido à eletropolimerização do pirrol-2-carboxílico (0,01 M). Os grupos carboxílicos derivados do filme de pirrol na superfície sensora foram ativados e em seguida incubados com uma solução de nanotubos de haloisita funcionalizados com grupos amina (5 mg/mL). Para imobilização dos anticorpos anti-troponina T, o eletrodo de carbono foi previamente incubado com uma solução de glutaraldeído (5%). Os sítios ativos remanescentes do eletrodo foram bloqueados com uma solução de glicina. A caracterização do imunossensor foi realizada usando as técnicas de voltametria cíclica e de pulso diferencial. A eletrossíntese do pirrol-2-carboxílico foi otimizada utilizando o perclorato de lítio como contra-íon na eletrossíntese do polímero, sob a velocidade de polimerização de 20 mV/s. O filme nanoestruturado de pirrol-2-carboxílico (0,01 M) e nanotubos de haloisita (5 mg/mL) apresentou uma estabilidade cinco vezes maior quando comparado ao estudo controle (sem pirrol-2-carboxílico). Ensaios para padronização da concentração do anticorpo anti-troponina T imobilizado e tempo de interação antígeno-anticorpo foram realizados e otimizados na concentração de 5 μg/mL e 60 min, respectivamente. Uma curva de calibração foi obtida para as diferentes concentrações de cTnT utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada. O imunossensor proposto apresentou uma boa linearidade com r=0,996 (p << 0,001; n = 6) e limite de detecção de 0,008 ng/mL. O filme nanohíbrido de pirrol-2-carboxílico e nanotubos de haloisita para detecção eletroquímica da troponina T demonstrou propriedades desejáveis, tais como estabilidade, reprodutibilidade e sensibilidade.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-19T15:38:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Sérgio Rocha para Defesa OK.pdf: 3444360 bytes, checksum: da9ca3f2c9d898e60430ef1b21bd681a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-19T15:38:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Sérgio Rocha para Defesa OK.pdf: 3444360 bytes, checksum: da9ca3f2c9d898e60430ef1b21bd681a (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / O infarto agudo do miocárdio (IAM) representa hoje um dos maiores problemas de saúde mundial prevalecendo sobre doenças como câncer, AIDS e doenças respiratórias. Em virtude da relevância, métodos cada vez mais eficientes para auxilio no diagnóstico do IAM vem sendo desenvolvidos. Um destes métodos, os aptassensores, chegam como ferramenta analítica alternativa para detecção de marcadores de necrose miocárdica. Neste trabalho um aptassensor simples e livre de marcação foi desenvolvido para detecção de troponina T cardíaca (cTnT), para isto, nanopartículas de prata foram sintetizadas eletroquimicamente sobre eletrodos impressos de tinta de carbono. Em seguida, 5 μL de cisteína foi adicionada à superfície sensora com intuito de servir de braço químico e possibilitar a imobilização do aptâmero. O aptâmero usado consiste em DNA fita simples modificado com grupos amino (NH2-ssDNA) e específico para o analito em questão. As condições ideais para imobilização do aptâmero e reconhecimento da molécula alvo, assim como a caracterização eletroquímica do aptassensor, foram investigados através das técnicas de voltametria cíclica (CV) e voltametria de pulso diferencial (DPV). A especificidade do aptassensor foi investigada utilizando para isso moléculas alvo específicas e inespecíficas. O reconhecimento do alvo apresentou alta sensibilidade com limite de detecção em 0,1 ng mL−1 de cTnT e uma boa reprodutibilidade (CV = 4%). O sensor também foi testado com amostras de soro humano, apresentando ótima concordância (95% de nível de confiança) com o padrão ouro, o método ECLIA. Neste trabalho pôde-se constatar que as nanopartículas de prata incorporadas a superfície eletródica melhoraram a reprodutibilidade, a condutividade e, consequentemente a resposta sensora, enquanto os aptâmeros asseguraram a sensibilidade e especificidade do aptasensor, apresentando, este modelo, grande potencial para uso no monitoramento dos níveis séricos de troponina cardíaca. / Acute myocardial infarction (AMI) it is one of the most serious diseases in the world responsible for approximately 17 million of deaths in 2012. Therefore, early diagnosis and prompt medical response are of paramount importance for patient survival. Aptasensors can be an alternative, which in combination with electrochemical techniques can provide the simplicity and speed required. A simple and sensitive label-free aptasensor for cardiac troponin T (cTnT) detection was successfully developed. For this purpose, it was chosen a DNA aptamers modified with amino group (NH2-ssDNA) specific to bind cTnT with a high specificity and stability. Herein, silver nanoparticles electrochemically synthesized and cysteine were used to modify the electrode, providing binding sites for aptamer immobilization. The optimum conditions for immobilization of the aptamer and target recognition were investigated by cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) technique. The aptasensor achieved a low limit of detection (0.3 ng mL−1) and a linear range between 0.1 and 10 ng mL−1 cTnT, significant for acute myocardial infarction diagnosis. Good reproducibility was obtained by the proposed aptasensor supported by a coefficient of variation of 4%. The silver nanoparticles incorporated to the electrode surface improved the reproducibility, while the aptamer secured the sensitivity of the biosensor. The sensor was also tested for human serum samples presenting a good agreement with the ECLIA methods at 95% confident level. This point-of-care approach presents a great potential for use in several situations releasing the aptasensor for use in the cardiac troponin detection.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-31T14:13:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese doutorado Bárbara V M Silva.pdf: 8451335 bytes, checksum: 8f05c2e3a44caad45cfbe00e5b36c3eb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-31T14:13:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese doutorado Bárbara V M Silva.pdf: 8451335 bytes, checksum: 8f05c2e3a44caad45cfbe00e5b36c3eb (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / CAPEs / A presente tese descreve o desenvolvimento de sensores eletroquímicos para imunoensaios empregando a tecnologia de eletrodos impressos com a finalidade de detectar a troponina T cardíaca, o marcador mais específico, atualmente, do infarto agudo do miocárdio. Um dos desafios na confecção de sensores eletroquímicos para imunoensaios é alcançar baixos limites de detecção. Nanomateriais de carbono são, recentemente, considerados excelentes estratégias no preparo de superfícies sensoras devido às suas excelentes propriedades, tais como rápida transferência elétrica e atividade catalítica, aumento da relação superfície/volume e, consequentemente, maior quantidade de biomoléculas imobilizadas. Nesta tese, nanotubos de carbono e grafeno foram utilizados sob diferentes abordagens para modificação de superfícies eletródicas. Um imunossensor baseado em eletrodos serigrafados obtidos pela impressão de filmes de nanotubos de carbono amino funcionalizados incorporados em tinta de carbono foi desenvolvido para detecção “livre de marcação”. Os grupos amino dos nanotubos expostos na interface sensora impressa foram utilizados para imobilização orientada dos anticorpos monoclonais anti-troponina T. Os nanofilmes impressos apresentaram uma excelente estabilidade e reprodutibilidade, exibindo um desvio padrão relativo (DP) menor que ~2% (n = 8), comparado com controle (DP ~9%, n = 8). A resposta analítica do sensor, obtida por voltametria de pulso diferencial, apresentou uma faixa linear entre 0,0025 e 0,5 ng/mL de troponina T (r = 0,995; p<0,0001; n=7), combinado a um baixo erro relativo (<<1%) e limite de detecção de 0,0035 ng/mL. Com o propósito de substituir os anticorpos anti-troponina T, visto que estes constituem parte onerosa do dispositivo, um sensor biomimético foi desenvolvido a partir de uma superfície nanoestruturada de grafeno e polipirrol. A técnica de impressão biomimética em superfície (“surface imprinting”) foi utilizada como estratégia para simplificar e reduzir em uma única etapa a produção das cavidades biomiméticas. Estas foram obtidas através da eletropolimerização do polipirrol e derivados copoliméricos orgânicos mimetizando grupos proteicos amino-reativos. As respostas analíticas do sensor foram geradas por voltametria de pulso diferencial, exibindo uma faixa linear de resposta variando de 0,01 a 0,1 ng/mL de troponina T (r = 0,9953; p<0,0001; n=5) e um limite de detecção de 0,006 ng/mL, mostrando um ótimo desempenho do sensor biomimético. As cavidades biomiméticas apresentaram uma constante de dissociação (KD) de 7,3 10- 13 mol/L, indicando boa afinidade à troponina quando comparadas com o sensor controle (sem troponina T), KD igual a 11,6 10-13 mol/L. Em conclusão, ambas as plataformas sensoras mostram potencial para detecção da troponina T em níveis de importância clínica no diagnóstico do infarto agudo, constituindo testes de pronto atendimento para emergências cardiológicas. / This thesis describes the development of electrochemical sensors for immunoassay by using a screen-printed electrodes technology in order to detect the human cardiac troponin T, the most important marker currently of the acute myocardial infarction. One of the challenges in the manufacturing of electrochemical sensors for immunoassays is to reach low limits of detection. Carbon nanomaterials are recently considered excellent strategies in preparing sensing surfaces due to theirs excellent properties, such as rapid electrical transfer and catalytic activity, increase surface / volume ratio and, consequently, offering higher amount of immobilized biomolecules. In this thesis, carbon nanotubes and graphene were used under different approaches in order to modify the sensors surfaces. An immunosensor based on screen printed electrode obtained by printing of amino functionalized carbon nanotubes films incorporated into carbon ink has been developed for "label-free" detection. The amino groups exposed on the imprinted sensor interface were utilized for oriented immobilization of the monoclonal antibody anti-troponin T. The imprinted nanofilms showed an excellent stability and reproducibility, exhibiting a relative standard deviation (RSD) less than ~2% (n = 8) compared to control (RSD ~9%, n = 8). The analytical response of the sensor, obtained by differential pulse voltammetry, showed a linear range between 0.0025 and 0.5 ng/mL (r = 0.995; p <0.0001, n = 7), combined with a low relative error (<< 1 %) and a calculated limit of detection of 0.0035 ng/mL. In order to replace the anti-troponin T antibody, since these are costly part of the device, a biomimetic sensor was developed from a nanostructured surface of graphene and polypyrrole. The biomimetic technique of surface imprinting was used as a strategy for simplify and reduce in a one-step production of the biomimetic cavities. These were obtained by electropolymerization of the pyrrole and its organic copolymers mimicking amino reactive protein groups. The analytical responses of the sensor were obtained by differential pulse voltammetry, exhibiting a linear range response in 0.01 and 0.1 ng/mL of troponin T (r = 0.9953; p <0.0001, n = 5) and a limit of detection of 0.006 ng/mL, showing a good performance of the biomimetic sensor. The biomimetic sites exhibited a dissociation constant (KD) of 7.3 10-13 mol/L, indicating a good affinity to troponin when compared to its control (without troponin T), KD equal to 11.6 10-13 mol/L. In conclusion, both sensor platform the sensor platforms showed a potential for troponin T detection in levels of clinical important for acute myocardial infarction diagnostic, constituting point-of-care testing for cardiac emergency departments.