En el presente trabajo de investigación, se mejoró la sensibilidad del método desarrollado para la detección de poblaciones de Ralstonia solanacearum en suelo naturalmente infestado. La efectividad de la etapa de enriquecimiento en un nuevo caldo semi-específico desarrollado en el Centro Internacional de la Papa (CIP), permitió incrementar la población bacteriana hasta límites detectables, logrando la semi-cuantificación de las mismas y la detección de niveles tan bajos como 16 cél/g suelo (80 cél/g suelo en promedio). La técnica de inmunoabsorción con conjugado enzimático del tipo sándwich de doble anticuerpo (ELISA-DAS) post-enriquecimiento, ha sido evaluada utilizando muestras de suelo de la rizósfera de plantas con síntomas de Marchitez Bacteriana de la papa (con altos niveles poblacionales) y desde allí en muestras distantes cada 15 cm. y en muestras de plantas circundantes, llegando a dispersarse hasta en 0.75m y 1.5m alrededor de la planta sintomática, respectivamente. La sensibilidad de la técnica utilizada ha sido demostrada en mezclas de suelo infestado con bajas concentraciones del patógeno (2.0x102 a 1.1x105 unidades formadoras de colonias /g suelo) y suelo no-infestado en proporciones de 1:2 a 1:6. Además, se desarrolló una estrategia de muestreo capaz de detectar la bacteria en campos de papa con bajos niveles de incidencia de la enfermedad. La supervivencia de Ralstonia solanacearum en suelo fue determinada después de 8 meses de barbecho o un descanso y una rotación con maíz hasta después de 3 meses de la cosecha del mismo (un total de 9 meses después de la cosecha de papa). La presencia de R. solanacearum en suelo procedente de plantas asintomáticas donde se cosecharon tubérculos latentemente infectados fue demostrada con la técnica ELISA-DAS post-enriquecimiento y confirmada por la Prueba de patogenicidad en tomate. En los campos de producción de semilla de zonas alto andinas (superior a 3 000 m.s.n.m) de 0.25 – 0.5 ha, el número de muestras necesarias para el análisis cualitativo en un 95 y 99% de posibilidades de detección fue de 20 y 31, respectivamente. Los resultados obtenidos bajo dos diferentes condiciones de campo permiten señalar que la técnica utilizada es altamente sensible e importante para su aplicación en el control de la Marchitez Bacteriana de la Papa en zonas paperas andinas de la provincia de Cajamarca. / In this investigation, the sensibility of method developed for detection of Ralstonia solanacearum populations in naturally infested soil has been improved. The effectiveness of the stage enrichment in a new semi-specific broth developed at the International Potato Center (CIP), allowed to increase bacterial populations until detectable boundary, achieved semi-quantification of the same and the levels as few as 16 cell/g soil (averaging 80 cells/g soil) were detected. DAS-ELISA (double antibody sandwich enzyme – linked immunoassay) post-enrichment technique has been evaluated in soil samples from the rhizosphere of bacterial wilt potato plants (high level populations) and, since then from soil samples each 15cm and neighbouring plants samples, arriving spread until 0,75cm and 1.5m around the wilted plant, respectively. The technique sensibility utilized in soil samples containing concentrations of the pathogen (2.0x102 to 1.1x105 ufc/g of soil) were selected and mixed with has been demostrated for the detection in diluted soil samples with non-infested soil in proportions of 1:2 to 1:6 has been demostrated. Furthermore one strategy sampling was able to detect bacteria in potato fields with low bacterial wilt incidences has been developed. Survival of Ralstonia solanacearum in soil was determined in field after 8-months fallow or a fallow and one rotation with maize, until 3 months after harvesting the same (a total of 9-months after potato harvest). The presence of Ralstonia solanacearum in soil samples of plants without visible bacterial wilt symptoms, but which test positive for latent infection in tubers for DAS-ELISA post-enrichment technique has been demostrated and confirm by the tomate bioassay patogeniticity. In each of the three seed-multiplication fields andean highlands (over 3000 m a.s.l.) of 0.25-0.5 ha, at 95% and 99% probabilities of detection, the number n of composite samples necessary to be analysed would be 20 and 31, respectively. The results obtained in two different sets of field conditions, allowed to show that the technique utilized is highly sensible and important for application in the control potato bacterial wilt in andean potato zones at Cajamarca province.

Al exponer el tubérculo de papa a temperaturas inferiores a los 7 °C, ocurre lo que se conoce como “endulzamiento por frío”. Este daño fisiológico, es la principal causa de rechazo de lotes de papa serrana para la industria, consiste en la acumulación de azúcares reductores (glucosa y fructosa) como resultado de la sucesiva degradación del almidón y sus componentes. Para ver la calidad de una papa almacenada en frío, sus niveles de azúcar deberán incrementarse en lo mínimo o no variar, para no perder su potencial como producto agroindustrial, caso contrario serviría para el procesamiento solo después de la cosecha. Por ello en el presente trabajo de tesis se seleccionó cultivares nativos de papa tolerantes al endulzamiento en frío, mediante su análisis fenotípico, bioquímico y molecular. Esto se desarrolló en las instalaciones del Centro Internacional de la Papa (CIP), en los laboratorios de Procesamiento, Fisiología y de Biología Molecular de la División de mejoramiento de cultivos. Se trabajó con 40 cultivares de papas nativas, seleccionadas anteriormente por su calidad de fritura teniendo como referente la relación entre: materia seca, fritura y azúcares reductores. / When potato tubers are exposed to temperatures lower than 7 °C, a process known as “Low Temperature Sweetening” takes place. This physiological damage involves the accumulation of the reducing sugars (glucose and fructose) as a result of successive degradation of the starch and its components, and is the principal reason native potato crops are rejected by industry. To maintain its potential as an agroindustrial product, a potato should be processed quickly (before sugars can accumulate) or be cold tolerant so if cold stored, will not change its levels of sugars much. To address this issue, the present thesis work selected native cultivars of potato resistant to cold induced sweetening, and characterized them phenotypically, biochemically, and genetically. This was done at the International Potato Research Institute (CIP), in the laboratories of the Processing, Physiology, and Molecular Biology Division of the department of Germplasm Improvement. There were 40 varieties of native potatoes, selected previously for their frying quality, dry matter content, and reducing sugar content.

Se realizó el análisis toxicológico de identificación y cuantificación del residuo de plaguicida organofosforado METHAMIDOPHOS en 20 muestras de papa en diferentes puestos de venta en el Departamento de Lima. El análisis cualitativo se realizó por cromatografía en capa fina (CCF) y el cuantitativo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se determinó presencia de Methamidophos en la totalidad de muestras analizadas. De los 10 muestreos realizados en mercados mayoristas: 7 muestreos (70%) exceden el Límite Máximo Residual (LMR) mostrando una concentración máxima de 2,7055 ppm de Methamidophos. De los 10 muestreos realizados en mercados minoristas: 2 muestreos (20%) exceden el LMR mostrando una concentración máxima de 0,1753 ppm de Methamidophos. Se concluyó que dichas concentraciones exceden el LMR establecido por el Codex Alimentarius (LMR iguala a 0,05 ppm). Palabras clave: Residuo Methamidophos, plaguicida, organofosforado, LMR, CCF, HPLC.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Las papas nativas constituyen el patrimonio genético de las generaciones presentes y futuras, es fuente de alimentación y seguridad alimentaria del mundo. Con el objetivo de evaluar la diversidad genética de papas nativas (Solanum spp.) de los distritos de Tambo y Anco de la provincia La Mar, se colectaron 50 cultivares procedentes del distrito de Tambo ubicado entre las altitudes de 3920 y 4047metros y, el distrito de Anco entre las altitudes de 3751 y 3984 metros. Se evaluó morfológicamente utilizando los descriptores de la “Guía para las caracterizaciones morfológicas básicas en colecciones de papas nativas del Centro Internacional de la Papa” y, molecularmente empleando el polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP). En la caracterización morfológica, utilizando algoritmos de UPGMA se determinó alta diversidad morfológica de los cultivares de papas nativas estudiadas y en el análisis de coordenadas principales, de los 28 descriptores morfológicos estudiados, los descriptores del tubérculo y del brote fueron poderosos y más informativos que otros descriptores para estudiar la diversidad morfológica. En el cálculo del índice estomático según la prueba de Tukey, se determinó diferencias estadísticamente significativas entre los promedios de los índices estomáticos de los cultivares en estudio. En el análisis molecular por AFLP, la digestión enzimática del ADN se realizó utilizando EcoRI y MseI. La combinación de los primersE38 – M49 y E37 – M50 fueron los más informativos obteniendo un índice de contenido polimórfico de 0,39 y 0,38. La lectura de la presencia o ausencia de bandas polimórficas de los morfotipos evaluados empleando el coeficiente de similitud Simple Matching y el análisis de agrupamiento según el algoritmo UPGMA originó un dendrograma con un índice de correlación cofenética de r= 0,7. El dendrograma con un coeficiente de similitud de 0,68 agrupó a los cultivares de papas nativas en 11 grupos y no se encontró cultivares duplicados a pesar de tener algunas características morfológicas semejantes. / Tesis

El tizón tardío causado por el oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, es la enfermedad más seria y devastadora en cultivos de papa alrededor del mundo. Aparte del uso de fungicidas, el uso de variedades resistentes es otro método para la protección de los cultivos contra esta enfermedad. Las especies silvestres de papa han demostrado ser una fuente continua de resistencia al tizón tardío en muchos programas de mejoramiento. Esta resistencia está controlada por genes R los cuales son fácilmente superados por razas nuevas de P. infestans, y/o por un número desconocido de genes que expresan un tipo cuantitativo de resistencia el cual podría ser más durable. Con el objetivo de caracterizar la resistencia a tizón tardío, 57 genotipos de una progenie diploide PCS1, originada del cruce entre Solanum paucissectum Ochoa 762126.227 (R) con S. paucissectum 762124.236 (S) fue analizada por medio de marcadores moleculares.La primera parte de la tesis estuvo enfocada en la evaluación de la técnica del perfil NBS (sitio de unión nucleotídica), estrategia basada en PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que eficientemente reconoce regiones cromosómicas que contienen genes R y análogos de genes R (RGAs) y al mismo tiempo produce marcadores polimórficos en estos genes. Los porcentajes de polimorfismo medio detectado al usar RsaI y HaeIII como enzimas de restricción fueron 11% y 8%, respectivamente. El número promedio de polimorfismo por combinación de iniciador-enzima fue igual a 5, con un rango que va desde 3 a 13 bandas polimórficas. Los resultados indican que el perfil NBS proporciona un medio efectivo para identificar polimorfismo en papa.La segunda parte se encontró enfocada en la evaluación de regiones genómicas responsables para resistencia a tizón tardío. La familia PCS1 fue analizada con 15 marcadores de ADN conocidos por estar ligados a QTL (locus de carácter cuantitativo) para resistencia en el genoma de la papa. Los fragmentos de ADN específicos basados en PCR fueron probados por asociación con este carácter cuantitativo analizado. Dos marcadores significativamente ligados a QTL para resistencia a P. infestans fueron encontrados en los cromosomas V y XI en la progenie PCS1. / --- Late blight caused by the oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is the most serious and devastating disease of potato production worldwide. Beside fungicides, the use of resistance varieties is another strategy to protect potato production against this disease. Wild potato species have proven to be a source of resistance to late blight used by much breeding programs. This resistance is controlled by R genes which may be easily overcome by new races of P. infestans, and/or by an unknown number of genes resulting in a quantitative type of resistance which may be more durable. With the goal of characterizing resistance to late blight, 57 genotypes of a PCS1 diploid offspring originated from cross among Solanum paucissectum Ochoa 762126.227 (R) with S. paucissectum 762124.236 (S) it was analyzed by means of molecular markers.The first part of the thesis focused on the evaluation of the NBS profiling technique, a strategy based on PCR (polymerase chain reaction) that efficiently it recognizes chromosomal regions containing R genes or R genes analogs (RGAs). At the same time it produces polymorphic markers for this gene. Mean polymorphic rates detected using RsaI and HaeIII as restriction enzymes were 11% and 8%, respectively. Mean number of polymorphisms per enzyme-primer combination was equal to 5, ranging from 3 to 13 polymorphic bands. Our results indicate that NBS profiling provides an effective means to identify polymorphism in potato.The second part of the thesis focused on the evaluation of genomic regions responsible for resistance to late blight. PCS1 family was genotyped with 15 DNA markers known to be linked to QTL (quantitative trait locus) for resistance on potato genome. Specific DNA fragments based on PCR were tested for association with this analyzed quantitative character. Two markers significantly linked to QTL for resistance to P. infestans were found on chromosomes V and XI in the PCS1 progeny.

Se realizaron estudios comparativos de sintomatología en plantas indicadoras, relaciones serológicas y relaciones moleculares de los PVS, PVM, PLV y PVP pertenecientes al género Carlavirus y que afectan al cultivo de la papa. Los rangos de infección en plantas indicadoras mostraron sintomatología variable desde el más amplio para PLV y los más estrechos para PVS, PVP y PVM. PVS infectó a Chenopodium quinoa de manera sistémica, mientras otros virus como PVM ocasionaron una infección local, en cambio PLV se mostró asintomático o no infección como PVP. Lycopersicon esculentum resultó ser una planta susceptible solamente a la infección con PVM, siendo la única característica que lo diferencia del PVP, en cambio PLV infectó a plantas poco comunes entre los Carlavirus como Physalis floridana, Nicotiana rustica y N. glutinosa. La reacciones heterólogas con anticuerpos policlonales (PAbs) no mostraron una relación serológica en DAS-ELISA entre los cuatro Carlavirus estudiados, pero sí una reactividad cruzada entre PVM y PVP en NCM-ELISA. Mediante PCR usando el iniciador universal Carla-U se amplificó regiones conservadas del gen 11k de los cuatro virus estimando productos comprendidos entre 100 a 200 bp. Los iniciadores específicos diseñados a partir de la cápside proteica de los virus PVS, PVM y PLV mostraron alta especificidad para cada uno de los virus. Igualmente los productos amplificados obtenidos y que se usaron como sondas no mostraron reacciones cruzadas entre ellas. Es el primer reporte de la secuencia del gen 11k de PVP la cual presentó una alta identidad con PVSA (variante andina) (70,9%). El nivel de identidad de los Carlavirus para el gen 11k resultó ser más baja (entre 24% y 41%) que la presentada al nivel de la región que codifica la proteína de la cápside (entre 25% y 79,4%). El análisis de secuencia que codifica la proteína de la cápside de los cuatro virus en relación con otros miembros del grupo mostraron que el aislamiento de PVS-CIP (peruano) corresponde a la variante andina (PVSA), y que la especie de PVM-CIP (peruano) presentó mayor identidad con el aislamiento “Idaho” (95,8%) (USA) que con aislamientos de Europa y Asia. Asimismo, PVSA presentó alta identidad con PLV-CIP y PRDV (virus del enanismo rugoso de la papa) (54,8% y 72% respectivamente) más no con PVSO (variante ordinaria)sugiriendo que estas dos nuevas especies podrían tener como antecesor común o mayor cercanía a PVSA. PRDV y PLV-CIP presentaron una identidad de 60,2% sugiriendo que estos dos nuevos virus, aún denominadas como tentativas del género Carlavirus por el Comité Internacional de Taxonomía (ICTV), sean consideradas como especies definitivas. La mayor incidencia encontrada en muestreos dentro del banco del germoplasma del CIP fue para PVS (49%) seguido por PLV (13,7%), PVM (8,7%) y PVP (5,13%). No fue posible la recuperación de algún aislamiento de PLV a partir de estos muestreos. En conclusión, basado en los resultados moleculares, PVP y PLV deberían ser considerados definitivamente en el género Carlavirus. Empleando una mezcla de PAbs en DAS-ELISA y una “polisonda” en NASH se logró la detección simultáneamente de los cuatro virus, lo cual reduce costos y tiempo cuando ambas pruebas son empleadas individualmente. / --- The relationship among four Carlaviruses species such as potato virus S, M, P (PVS, PVM, PVP) and potato latent virus (PLV Syn. Red LaSoda Virus) affecting potato crop were studied using three criteria: Biological (symptomatology in host plants), serological and molecular relationships. Symptomlogically, PLV infected a wider range of host plants than PVS, PVM and PVP. Virus PVS caused a systemic infection to Chenopodium quinoa plants while other members caused a local infection (PVM), symptomless infection (PLV) and not infection (PVP) in that plant. Lycopersicon esculentum was the only host plant that get infected with PVM, in the other hand infection with PLV was generally symptomless and found in plants that are uncommon for the Carlavirus genera like Physalis floridana, Nicotiana rustica and N. glutinosa. PVP and PVM caused a similar range of infection in host plants. Serologically PVS, PVM, PLV and PVP were evaluated using double antibody sandwich enzyme-linked immnosorbent assay (DAS-ELISA). This test did not show a relevant relationship or cross-reactions, it is probably because of the high specificity of DAS-ELISA (Koenig, 1978), there was only an exception when PVS antibody cross-reacted with CVB (Chrysanthemum Virus B). This, however, did not seem to be equal when the same viruses were evaluated on indirect NCM-ELISA test where a weak cross-reaction was observed between PVM and PVP. Molecularly, primer carla-uni (Badge et al., 1996) has been shown to be a primary tool for Carlaviruses when RT-PCR was carried out on PVS, PVM, PLV and PVP, and usually gives a PCR product of about 120 bp in all four viruses. Specific primers designed to amplifying the coat protein sequence for PVS, PLV and PVM have shown a total specificity, maybe because of the low homology in this region. These three PCR products were cloned, then used to develop probes and finally tested in Nucleic Acid Spot Hybridization (NASH), so that specificity was confirmed because the probes hybridized only with their complementary pathogens. These specific probes were combined to form “Polyprobe” to achieve a simultaneous detection of PVS, PVM and PLV in a radioactive and no radioactive NASH tests. The successfully developed assay was tested with material that was processed from both in greenhouse and field in order to detect these three viruses. This is the first report of the partial sequence of 11k gene of PVP, which shown high homology with the same region of PVSA (70,9%). Nucleotides identity among Carlavirus 11k gene (between 24 and 41%) was lower than the one among coat protein regions (between 25 and 79,4 %). Alignments of the partial coat protein showed clearly that PVS-CIP was identical to PVSA (91%), while PVM-CIP was identitcal to PVM “Idaho” (95,8%) and PLV showed a high similarity with PVM-CIP (64,7%.) PVS showed the highest incidence (49%), then PLV (13,7%), PVM (8,7%) and the lowest PVP (5,13%) in the native Andean cultivar collection maintained at CIP. In conclusion, all these pathogens can be classified as distinct Carlavirus members, according to their biological, serological and molecular traits. Furthermore, this work showed modifications of standard detection tests like simultaneous detections in order to simplify the technique and reduce costs and time.

El tizón tardío, causado por el oomiceto Phytophthora infestans, es la enfermedad más devastadora que ataca a la papa alrededor del mundo. La resistencia horizontal a tizón tardío, controlada por QTLs, es la de mayor uso en los programas de mejoramiento convencional debido a su mayor durabilidad. Mediante la detección de 8 QTLs que determinan este tipo de resistencia, ésta ha sido caracterizada en una población diploide (PD), que proviene del cruce entre Solanum phureja (phu) (CHS-625) (2n=2x=24) (P) x Solanum tuberosum dihaploide (dih-tbr) (PS-3) (n=2x=24) (D). El QTL del cromosoma XII del parental dih-tbr fue reportado como el más importante de los detectados debido a su gran contribución a la resistencia y a su asociación con marcadores ligados a genes que intervienen en rutas bioquímicas de defensa. Cuatro marcadores AFLP ligados al QTL tbr-XII fueron seleccionados para su conversión en marcadores de secuencia específica con el objetivo de facilitar su detección a gran escala en poblaciones segregantes. La técnica de PCR inversa (i-PCR) fue implementada como estrategia para la búsqueda de polimorfismo. Se desarrolló un marcador SCAR y un marcador CAPS para dicho QTL mediante i-PCR. Los otros dos marcadores SCAR fueron obtenidos directamente de la secuencia AFLP. La similitud de los patrones de segregación de los marcadores AFLP originales y los marcadores de secuencia específica obtenidos indica que éstos pueden ser empleados para detectar y/o acelerar la introgresión del QTL tbr-XII en variedades cultivadas. Adicionalmente, se secuenciaron 8 marcadores AFLP que podrían ser útiles para el diseño de marcadores de fácil uso / ---Late blight (LB) caused by the oomycete Phytophthora infestans, is the most severe potato disease worldwide. Horizontal resistance to late blight, governed by QTLs, is the most used in breeding programs because of its longer durability, and it has been characterized in a 2x Solanum population (PD) resulted from a cross between Solanum phureja (phu) (CHS-625) (2n=2x=24) (P) x Solanum tuberosum dihaploide (dih-tbr) (PS-3) (n=2x=24) (D). Eight QTL were detected by interval mapping methods. The QTL at chromosome XII of dihaploid S. tuberosum was reported as the most important one detected in the PD population because of its high contribution to field resistance and association to defense-related markers. Four Amplified Fragments Length Polymorphism (AFLP) linked to QTL tbr-XII were selected for conversion into sequence-specific markers in order to facilitate its detection in subsequent large progenies. Three Sequence Characterized Amplified Regions (SCAR) and one Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers have been developed for this QTL. Markers were converted by using inverse Polymerase Chain Reaction (iPCR) approach and by using the sequence of the original AFLP. Testing of these markers in the PD population confirmed their linkage to the QTL tbr-XII. Therefore, the developed markers can be applied to accelerate the introgression of this QTL into advanced breeding material. Additionally, eight AFLP markers were sequenced and may be useful for PCR-based markers designing

El tizón tardío causado por el oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, es la enfermedad más seria y devastadora en cultivos de papa alrededor del mundo. Aparte del uso de fungicidas, el uso de variedades resistentes es otro método para la protección de los cultivos contra esta enfermedad. Las especies silvestres de papa han demostrado ser una fuente continua de resistencia al tizón tardío en muchos programas de mejoramiento. Esta resistencia está controlada por genes R los cuales son fácilmente superados por razas nuevas de P. infestans, y/o por un número desconocido de genes que expresan un tipo cuantitativo de resistencia el cual podría ser más durable. Con el objetivo de caracterizar la resistencia a tizón tardío, 57 genotipos de una progenie diploide PCS1, originada del cruce entre Solanum paucissectum Ochoa 762126.227 (R) con S. paucissectum 762124.236 (S) fue analizada por medio de marcadores moleculares.La primera parte de la tesis estuvo enfocada en la evaluación de la técnica del perfil NBS (sitio de unión nucleotídica), estrategia basada en PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que eficientemente reconoce regiones cromosómicas que contienen genes R y análogos de genes R (RGAs) y al mismo tiempo produce marcadores polimórficos en estos genes. Los porcentajes de polimorfismo medio detectado al usar RsaI y HaeIII como enzimas de restricción fueron 11% y 8%, respectivamente. El número promedio de polimorfismo por combinación de iniciador-enzima fue igual a 5, con un rango que va desde 3 a 13 bandas polimórficas. Los resultados indican que el perfil NBS proporciona un medio efectivo para identificar polimorfismo en papa.La segunda parte se encontró enfocada en la evaluación de regiones genómicas responsables para resistencia a tizón tardío. La familia PCS1 fue analizada con 15 marcadores de ADN conocidos por estar ligados a QTL (locus de carácter cuantitativo) para resistencia en el genoma de la papa. Los fragmentos de ADN específicos basados en PCR fueron probados por asociación con este carácter cuantitativo analizado. Dos marcadores significativamente ligados a QTL para resistencia a P. infestans fueron encontrados en los cromosomas V y XI en la progenie PCS1. / Late blight caused by the oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is the most serious and devastating disease of potato production worldwide. Beside fungicides, the use of resistance varieties is another strategy to protect potato production against this disease. Wild potato species have proven to be a source of resistance to late blight used by much breeding programs. This resistance is controlled by R genes which may be easily overcome by new races of P. infestans, and/or by an unknown number of genes resulting in a quantitative type of resistance which may be more durable. With the goal of characterizing resistance to late blight, 57 genotypes of a PCS1 diploid offspring originated from cross among Solanum paucissectum Ochoa 762126.227 (R) with S. paucissectum 762124.236 (S) it was analyzed by means of molecular markers.The first part of the thesis focused on the evaluation of the NBS profiling technique, a strategy based on PCR (polymerase chain reaction) that efficiently it recognizes chromosomal regions containing R genes or R genes analogs (RGAs). At the same time it produces polymorphic markers for this gene. Mean polymorphic rates detected using RsaI and HaeIII as restriction enzymes were 11% and 8%, respectively. Mean number of polymorphisms per enzyme-primer combination was equal to 5, ranging from 3 to 13 polymorphic bands. Our results indicate that NBS profiling provides an effective means to identify polymorphism in potato.The second part of the thesis focused on the evaluation of genomic regions responsible for resistance to late blight. PCS1 family was genotyped with 15 DNA markers known to be linked to QTL (quantitative trait locus) for resistance on potato genome. Specific DNA fragments based on PCR were tested for association with this analyzed quantitative character. Two markers significantly linked to QTL for resistance to P. infestans were found on chromosomes V and XI in the PCS1 progeny.

Se realizaron estudios comparativos de sintomatología en plantas indicadoras, relaciones serológicas y relaciones moleculares de los PVS, PVM, PLV y PVP pertenecientes al género Carlavirus y que afectan al cultivo de la papa. Los rangos de infección en plantas indicadoras mostraron sintomatología variable desde el más amplio para PLV y los más estrechos para PVS, PVP y PVM. PVS infectó a Chenopodium quinoa de manera sistémica, mientras otros virus como PVM ocasionaron una infección local, en cambio PLV se mostró asintomático o no infección como PVP. Lycopersicon esculentum resultó ser una planta susceptible solamente a la infección con PVM, siendo la única característica que lo diferencia del PVP, en cambio PLV infectó a plantas poco comunes entre los Carlavirus como Physalis floridana, Nicotiana rustica y N. glutinosa. La reacciones heterólogas con anticuerpos policlonales (PAbs) no mostraron una relación serológica en DAS-ELISA entre los cuatro Carlavirus estudiados, pero sí una reactividad cruzada entre PVM y PVP en NCM-ELISA. Mediante PCR usando el iniciador universal Carla-U se amplificó regiones conservadas del gen 11k de los cuatro virus estimando productos comprendidos entre 100 a 200 bp. Los iniciadores específicos diseñados a partir de la cápside proteica de los virus PVS, PVM y PLV mostraron alta especificidad para cada uno de los virus. Igualmente los productos amplificados obtenidos y que se usaron como sondas no mostraron reacciones cruzadas entre ellas. Es el primer reporte de la secuencia del gen 11k de PVP la cual presentó una alta identidad con PVSA (variante andina) (70,9%). El nivel de identidad de los Carlavirus para el gen 11k resultó ser más baja (entre 24% y 41%) que la presentada al nivel de la región que codifica la proteína de la cápside (entre 25% y 79,4%). El análisis de secuencia que codifica la proteína de la cápside de los cuatro virus en relación con otros miembros del grupo mostraron que el aislamiento de PVS-CIP (peruano) corresponde a la variante andina (PVSA), y que la especie de PVM-CIP (peruano) presentó mayor identidad con el aislamiento “Idaho” (95,8%) (USA) que con aislamientos de Europa y Asia. Asimismo, PVSA presentó alta identidad con PLV-CIP y PRDV (virus del enanismo rugoso de la papa) (54,8% y 72% respectivamente) más no con PVSO (variante ordinaria)sugiriendo que estas dos nuevas especies podrían tener como antecesor común o mayor cercanía a PVSA. PRDV y PLV-CIP presentaron una identidad de 60,2% sugiriendo que estos dos nuevos virus, aún denominadas como tentativas del género Carlavirus por el Comité Internacional de Taxonomía (ICTV), sean consideradas como especies definitivas. La mayor incidencia encontrada en muestreos dentro del banco del germoplasma del CIP fue para PVS (49%) seguido por PLV (13,7%), PVM (8,7%) y PVP (5,13%). No fue posible la recuperación de algún aislamiento de PLV a partir de estos muestreos. En conclusión, basado en los resultados moleculares, PVP y PLV deberían ser considerados definitivamente en el género Carlavirus. Empleando una mezcla de PAbs en DAS-ELISA y una “polisonda” en NASH se logró la detección simultáneamente de los cuatro virus, lo cual reduce costos y tiempo cuando ambas pruebas son empleadas individualmente. / The relationship among four Carlaviruses species such as potato virus S, M, P (PVS, PVM, PVP) and potato latent virus (PLV Syn. Red LaSoda Virus) affecting potato crop were studied using three criteria: Biological (symptomatology in host plants), serological and molecular relationships. Symptomlogically, PLV infected a wider range of host plants than PVS, PVM and PVP. Virus PVS caused a systemic infection to Chenopodium quinoa plants while other members caused a local infection (PVM), symptomless infection (PLV) and not infection (PVP) in that plant. Lycopersicon esculentum was the only host plant that get infected with PVM, in the other hand infection with PLV was generally symptomless and found in plants that are uncommon for the Carlavirus genera like Physalis floridana, Nicotiana rustica and N. glutinosa. PVP and PVM caused a similar range of infection in host plants. Serologically PVS, PVM, PLV and PVP were evaluated using double antibody sandwich enzyme-linked immnosorbent assay (DAS-ELISA). This test did not show a relevant relationship or cross-reactions, it is probably because of the high specificity of DAS-ELISA (Koenig, 1978), there was only an exception when PVS antibody cross-reacted with CVB (Chrysanthemum Virus B). This, however, did not seem to be equal when the same viruses were evaluated on indirect NCM-ELISA test where a weak cross-reaction was observed between PVM and PVP. Molecularly, primer carla-uni (Badge et al., 1996) has been shown to be a primary tool for Carlaviruses when RT-PCR was carried out on PVS, PVM, PLV and PVP, and usually gives a PCR product of about 120 bp in all four viruses. Specific primers designed to amplifying the coat protein sequence for PVS, PLV and PVM have shown a total specificity, maybe because of the low homology in this region. These three PCR products were cloned, then used to develop probes and finally tested in Nucleic Acid Spot Hybridization (NASH), so that specificity was confirmed because the probes hybridized only with their complementary pathogens. These specific probes were combined to form “Polyprobe” to achieve a simultaneous detection of PVS, PVM and PLV in a radioactive and no radioactive NASH tests. The successfully developed assay was tested with material that was processed from both in greenhouse and field in order to detect these three viruses. This is the first report of the partial sequence of 11k gene of PVP, which shown high homology with the same region of PVSA (70,9%). Nucleotides identity among Carlavirus 11k gene (between 24 and 41%) was lower than the one among coat protein regions (between 25 and 79,4 %). Alignments of the partial coat protein showed clearly that PVS-CIP was identical to PVSA (91%), while PVM-CIP was identitcal to PVM “Idaho” (95,8%) and PLV showed a high similarity with PVM-CIP (64,7%.) PVS showed the highest incidence (49%), then PLV (13,7%), PVM (8,7%) and the lowest PVP (5,13%) in the native Andean cultivar collection maintained at CIP. In conclusion, all these pathogens can be classified as distinct Carlavirus members, according to their biological, serological and molecular traits. Furthermore, this work showed modifications of standard detection tests like simultaneous detections in order to simplify the technique and reduce costs and time.

El tizón tardío, causado por el oomiceto Phytophthora infestans, es la enfermedad más devastadora que ataca a la papa alrededor del mundo. La resistencia horizontal a tizón tardío, controlada por QTLs, es la de mayor uso en los programas de mejoramiento convencional debido a su mayor durabilidad. Mediante la detección de 8 QTLs que determinan este tipo de resistencia, ésta ha sido caracterizada en una población diploide (PD), que proviene del cruce entre Solanum phureja (phu) (CHS-625) (2n=2x=24) (P) x Solanum tuberosum dihaploide (dih-tbr) (PS-3) (n=2x=24) (D). El QTL del cromosoma XII del parental dih-tbr fue reportado como el más importante de los detectados debido a su gran contribución a la resistencia y a su asociación con marcadores ligados a genes que intervienen en rutas bioquímicas de defensa. Cuatro marcadores AFLP ligados al QTL tbr-XII fueron seleccionados para su conversión en marcadores de secuencia específica con el objetivo de facilitar su detección a gran escala en poblaciones segregantes. La técnica de PCR inversa (i-PCR) fue implementada como estrategia para la búsqueda de polimorfismo. Se desarrolló un marcador SCAR y un marcador CAPS para dicho QTL mediante i-PCR. Los otros dos marcadores SCAR fueron obtenidos directamente de la secuencia AFLP. La similitud de los patrones de segregación de los marcadores AFLP originales y los marcadores de secuencia específica obtenidos indica que éstos pueden ser empleados para detectar y/o acelerar la introgresión del QTL tbr-XII en variedades cultivadas. Adicionalmente, se secuenciaron 8 marcadores AFLP que podrían ser útiles para el diseño de marcadores de fácil uso / Late blight (LB) caused by the oomycete Phytophthora infestans, is the most severe potato disease worldwide. Horizontal resistance to late blight, governed by QTLs, is the most used in breeding programs because of its longer durability, and it has been characterized in a 2x Solanum population (PD) resulted from a cross between Solanum phureja (phu) (CHS-625) (2n=2x=24) (P) x Solanum tuberosum dihaploide (dih-tbr) (PS-3) (n=2x=24) (D). Eight QTL were detected by interval mapping methods. The QTL at chromosome XII of dihaploid S. tuberosum was reported as the most important one detected in the PD population because of its high contribution to field resistance and association to defense-related markers. Four Amplified Fragments Length Polymorphism (AFLP) linked to QTL tbr-XII were selected for conversion into sequence-specific markers in order to facilitate its detection in subsequent large progenies. Three Sequence Characterized Amplified Regions (SCAR) and one Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers have been developed for this QTL. Markers were converted by using inverse Polymerase Chain Reaction (iPCR) approach and by using the sequence of the original AFLP. Testing of these markers in the PD population confirmed their linkage to the QTL tbr-XII. Therefore, the developed markers can be applied to accelerate the introgression of this QTL into advanced breeding material. Additionally, eight AFLP markers were sequenced and may be useful for PCR-based markers designing